黃綠卷毛菇生境中矮嵩草內生真菌多樣性比較研究

郭璟 謝占玲 羅濤 薛治峰 郭建娟 李發雄 張秀娟

（青海大學生態環境工程學院 青海省高原作物種質資源創新與利用重點實驗室，西寧 810016）

黃綠卷毛菇（Floccularia luteovirens）作為青藏高原高寒草原與草甸生態系統中最具有代表性的真菌之一［1］，不僅是名貴食藥用真菌，而且也是重要的高原生物資源［2］。青藏高原是黃綠卷毛菇最主要的發生地，黃綠卷毛菇主要生長在矮嵩草草甸，高山嵩草、異針茅草原化草甸，嵩草雜草類草甸，垂穗披堿草草甸［3］。對于黃綠卷毛菇菌絲體的培養，早期的研究發現黃綠卷毛菇菌絲對碳源的利用以紅糖為最佳，以酵母膏為最佳氮源，適宜的碳氮比為20-50∶1［4］。此后的研究結果顯示，該菌適宜碳源為蔗糖，氮源為蛋白胨，適宜的碳氮比為10∶1，最佳礦質營養元素是硫酸鎂［5］，最適pH為6.5，在暗處培養生長最佳［6］。然而黃綠卷毛菇菌絲體的人工培養困難，產量低且菌絲體生物量發酵培養方面未見報道，人工種植目前尚未成功［7］。

內生真菌廣泛存在植物的組織中，它與植物之間存在著復雜的分子調控機制［8］，研究表明內生真菌可以提高植物的分蘗數，增加植物的地上和地下的生物量［9］。矮嵩草、二柱頭藨草和高山嵩草是青藏高原高寒草甸中的建群種［10］。目前對青藏高原植物的內生真菌研究比較少，張苗苗等［11］對甘肅省甘南州瑪曲草原的線葉嵩草進行內生真菌的分離及其抗菌性質的研究，分離到7株內生真菌且部分具有抗菌活性。Zhang等［12］對祁連的3種灌木土壤的真菌多樣性進行研究，采用培養和分子鑒定的方法對菌種進行了鑒定。

本實驗以黃綠卷毛菇生境中的矮嵩草為研究對象，采取黃綠卷毛菇0 cm、10 cm、20 cm及對照處的矮嵩草，通過傳統培養法與宏基因組測序法，研究黃綠卷毛菇生境中矮嵩草的內生真菌多樣性，確定黃綠卷毛菇在植物中的內生真菌的地位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 矮嵩草樣品 本實驗所用矮嵩草2018年8月采自青海省海北州海晏縣（海拔3200 m）高寒嵩草草甸。

1.1.2 培養基 PDA培養基：200 g土豆，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1000 mL水。

1.2 方法

1.2.1 矮嵩草植物的處理與消毒 傳統法使用5株植物，植物葉子、基部、根各選取3份。其中葉子選取1 cm長度，基部除去其包被鞘，根部選取1-1.5cm長度。對選取的植物組織用自來水沖洗3次，蒸餾水漂洗3次，除去表面灰塵泥土。

宏基因組法選取距黃綠卷毛菇0 cm、10 cm、20 cm及對照處的矮嵩草，分為主根、側根、基部，樣品編號為：F-Z0、F-C0、F-J0、F-Z10、F-C10、F-J10、F-Z20、F-C20、F-J20、F-ZD、F-CD及 F-JD。植物組織同傳統法作相同處理。

植物組織用5.25%次氯酸鈉浸泡5 min，用無菌水漂洗4次以充分除去殘留的次氯酸鈉，再使用0.1%氯化汞浸泡植物組織5 min，最后用無菌水漂洗3次。

1.2.2 DNA提取 內生真菌培養使用PDA培養基，經過分離純化后采用CTAB法［13］提取DNA，使用ITS1和ITS4擴增真菌的ITS序列［14］，送至上海生物工程有限公司測序。宏基因組法采用CTAB［13］法提取植物根總DNA，檢測合格的DNA樣品由上海生物工程有限公司進行16S rRNA基因的V3-V4可變區擴增并測序，采用 Illumina MiseqTM平臺進行雙末端測序。

1.2.3 數據處理 對于測序結果使用的軟件有BioEdit、Sequencher、MEGA7， 數 據 庫 使 用 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫。多樣性指數、豐富度指數、均勻度指數計算采用柴新義等方法［15］。

2 結果

2.1 傳統分離培養法

2.1.1 內生真菌的分離 傳統方法經過分離鑒定得到66株內生真菌，在真菌的分布上，基部（6.6）＞根（4.2）＞葉（2）（表1）。

表1 傳統法分離菌株的統計

2.1.2 內生真菌菌群組成的多樣性分析 分離鑒定的66株菌均為子囊菌，分布于7目10屬，結果如表2所示，包括木霉屬（Trichoderma）、Stachybotriaceae、柱頂孢霉屬（Scytalidium）、鐮刀菌屬（Fusariumsp）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、微座孢屬（Microdochiumsp.）、青霉菌屬（Penicillium）、毛霉屬（Mucor）、鏈格孢屬（Alternaria alternata）、殼多孢屬（Stagonospora）。其中，殼多孢屬（Stagonospora）21株，占所分離菌株的31.82%，為優勢菌屬。

表2 傳統分離培養法66株內生真菌分布情況

對傳統法培養的內生真菌的多樣性進行分析見表3，根的多樣性指數（1.95）＞基部的多樣性指數（1.78）＞葉片的多樣性指數（1.17）。在豐富度指數上，基部的豐富度指數（1.95）＞根的豐富度指數（1.82）＞葉的豐富度指數（0.90）。根的均勻度指數（0.89）＞葉子的均勻度指數（0.84）＞基部的均勻度指數（0.74），表明矮嵩草中不同的組織中，內生真菌的數量種類是存在差異的。

傳統分離方法內生真菌相對豐度結果見表4。主要分離到的是優勢菌株：Stagonospora bicolor、Trichoderma rossicum、Colletotrichumsp.、uncultured fungus和Pleosporales sp.。在根組織中Stagonosporabicolor（7.58）和uncultured fungus的相對多度最高（7.58），基部中Stagonospora bicolor相對多度最高（24.24），葉子中Colletotrichumsp.的相對多度最高（7.58）。表明在矮嵩草植物中不同組織中的內生真菌優勢菌株是不同的。

表3 傳統法內生真菌菌群多樣性指數

表4 傳統方法內生真菌相對豐度

2.1.3 內生真菌菌群組成 采用鄰接法（Neighbor-Joining methods，NJ）構建進化樹如圖1，從進化樹可以看出所有菌株可以分為3個分支，其中毛霉屬Mucor和uncultured fungus MH30052分別占據2個分支，剩下的一支可以分類到6個大類。66株菌的NCBI登陸號為MH299988-MH300053。未分離到黃綠卷毛菇。

圖1 基于ITS基因部分序列構建的部分菌株的Neighbour-Joining系統進化樹

2.2 宏基因組法

2.2.1 內生真菌的分離 宏基因組法，12份樣品的OTU在屬的水平上展示如圖2，在各個樣品之間，屬的分布是不同的，占比最多的是Fusarium。

2.2.2 內生真菌菌群組成的多樣性分析 基于宏基因組測序結果，其中12個樣品共分離鑒定到種水平的OTU數目為587，Fusariumsp相對豐度是最高的，平均值為17.15；而在傳統分離的方法中，uncultured fungus和Stagonospora bicolor是相對多度最高，均為7.58（表5）。此外，雖然使用的是相同的組織樣品，對于多數的內生真菌是比較難培養的，傳統法中分離的菌種占宏基因組的1.70%（10/587）。

圖2 屬水平所有樣本群落結構分布圖

宏基因組的結果分析顯示見表6，12份根的樣品中，不同樣品的多樣性指數，豐富度指數，均勻度指數是不同的。多樣性指數平均值為3.13、豐富度指數平均值為39.08、均勻度指數平均值為0.48。矮嵩草植物的不同組織中，多樣性指數、豐富度指數、均勻度指數表現為：側根＞主根＞基部。

2.2.3 內生真菌菌群組成 傳統分離方法所得到的全部菌株均分類到子囊菌中，而宏基因組法分析豐度如圖3所示，其進化組成關系中內生真菌的組成中有子囊菌門（Ascomycota）占77.21%、擔子菌門（Basidiomycota）占16.21%，剩下的6.58%為unclassified真菌，傳統法未分離到擔子菌的內生真菌。表明在傳統分離真菌的過程中，子囊菌真菌是屬于易培養的真菌，而擔子菌真菌不易被培養。

2.3 傳統分離培養法與宏基因組法的比較

傳統法共分離到66株內生真菌，均分類到子囊菌門中，優勢菌屬為殼多孢屬，而宏基因組法共檢測到587種內生真菌，內生真菌的組成中有子囊菌門、擔子菌門，且傳統多樣性指數（1.63）＜宏基因組法的均值（3.13），傳統法豐富度指數（1.56）＜宏基因組的均值（39.08），傳統法均勻度指數（0.82）＞宏基因組的均值（0.48），如表7所示。

3 討論

本研究利用傳統分離培養法并結合宏基因法，對青藏高原地區矮嵩草植物內生真菌多樣性進行了研究。傳統方法分離到66株內生真菌，遠遠多于張苗苗等［11］對甘肅省甘南州瑪曲草原的線葉嵩草內生真菌的分離，共分離到7株內生真菌分別為鐮刀菌屬Fusarium、枝頂孢屬Acremoniumsp、黑團孢霉屬Periconiasp。在本研究中也分離到了鐮孢屬，但并沒有分離到枝頂孢屬和黑團孢霉屬這兩屬的內生真菌。但在本研究中還分離出其它屬的內生真菌，多樣性結果分析結果顯示，在矮嵩草植物中，根和基部的多樣性指數大于葉子的多樣性指數，基部和根的豐富度指數均大于葉片，表明矮嵩草的內生真菌主要分布于基部和根，葉子分布較少，這可能與根際土壤微生物群落對植物體的作用有關［16］。

表5 宏基因組法內生真菌相對豐度

表6 宏基因組法內生真菌菌群多樣性指數

傳統培養與直接PCR法對菌根真菌的研究在其它植物中有相關的報道［17］，而宏基因組法對矮嵩草植物內生真菌的研究未見相關報道，12組根樣品共檢測到587種內生真菌，而且內生真菌的組成存在差異，表明不同個體的內生真菌的組成可能存在差異。世界上大部分真菌在實驗室很難培養出來［18］，傳統分離方法分離的菌株占宏基因組的1.70%（10/587），很大一部分的真菌并未被分離出來，這可能是因為培養技術只能培養很少一部分微生物，大部分微生物難以培養，純培養技術不能精確反映環境微生物的真實生存狀況［19］。研究內生真菌本身，傳統方法更為可靠具有后續研究的優勢［20］，但面對未開發的真菌，特別是擔子菌綱的真菌，很大的不足還是缺乏宿主系統［21］。利用宏基因組技術可以探明內生真菌群落的組成［22］，且能夠更有效、更可靠地評估真菌的豐富度［23］。在對傳統與宏基因組的多樣性指數、豐富度指數、均勻度指數的比較分析上，傳統方法多樣性指數和豐富度指數是低于宏基因組法的均值，而在均勻度指數上傳統法大于宏基因組法，這樣的結果可能是由于真菌的對培養基的選擇，篩選出來的真菌是在PDA中的優勢菌株和易培養菌株，這與Elizabeth等［24］所說明的培養的方法低估了內生真菌的多樣性相類似，不同的方法存在著某種特殊的偏好性。而這些菌株的分布比較大，所以會造成指標的偏離，不能真實的展示內生真菌的多樣性和差異性。所以推測環境因素對植物內生真菌的影響以及個體差異可能體現在那些非優勢菌株中的變化上，而不是優勢菌株。

圖3 GraPhlAn繪制的分類和系統發育信息可視化圖

表7 宏基因組法與傳統法的比較

通過兩種方法的比較發現，傳統分離培養法未分離到黃綠卷毛菇，而宏基因組法分離到相對豐度為11.39的黃綠卷毛菇，可能原因為黃綠卷毛菇生長緩慢，需要加富營養，而傳統的培養法用PDA平板培養，未能達到自然生境中的營養要求。關于黃綠卷毛菇人工種植目前尚未成功，菌根類型的研究及確定將是今后研究的方向。

4 結論

傳統分離培養法共分離鑒定得到66株內生真菌均為子囊菌門（Ascomycota），優勢種群為Stagonospora bicolor；宏基因組法檢測到587種內生真菌，子囊菌門占77.21%、擔子菌門（Basidiomycota）占16.21%，剩下的6.58%為unclassified真菌，優勢種群為Fusariumsp.。傳統法多樣性指數和豐富度指數均小于宏基因組法，均勻度指數大于宏基因組法。黃綠卷毛菇生境的矮嵩草植物中，蘊含著豐富的內生真菌資源，黃綠卷毛菇為優勢內生真菌種群之一。