哈茨木霉SKD-ZX-1的鑒定、發酵及其生防效果

陸洪省 張雪 高宇婷 孫珮銘 邱萌萌

（山東科技大學化學與環境工程學院，青島 266590）

土傳病害是一類重要的植物病害，主要以土壤為傳播媒介，從植物的根部侵染植株，最后引起植株整株死亡，給農業生產造成巨大的損失［1］。在治理土壤病蟲害的過程中，長期大量使用高毒、高殘留的化學農藥對蔬菜、糧食作物等種植土壤造成了非常嚴重的污染。由于化學藥劑對環境污染問題日益突出，生物防治越來越引起人們的關注［2］。

木霉屬（Trichoderma）作為一類重要的生防真菌，廣泛存在于自然界中，具有適應性強、存在范圍廣和高效等優點［3］。木霉屬包括多個菌種，如綠色木霉（Trichoderma viride）、康寧木霉（Trichoderma koningii）、棘孢木霉（Trichoderma asperellum）、深綠 木 霉（Trichoderma atroviride）、 哈 茨 木 霉（T.harzianum）、長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）等，其中哈茨木霉菌是木霉菌屬中應用最廣的一個菌種。哈茨木霉能夠有效的防治鐮刀菌（Fusarium）、腐 霉 菌（Pythium）、 立 枯 絲 核 菌（Rhizoctonia solani）、人參銹腐病菌（Cylindrocarpon destructans）、禾谷絲核菌（Rhizoctonia ce-realis）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）等引起的植物白絹病、幼苗枯病、疫霉病、人參銹腐病、小麥紋枯病、番茄灰霉病等，是多種植物病原菌的拮抗菌和寄生菌，已作為生防制劑廣泛用于農業領域［4-8］，而且哈茨木霉可以產生多種能夠促進植物的生長和提高植物的抗病性的活性次級代謝產物［9-10］。鏈格孢是經濟上重要的真菌屬之一。大多數種類兼性寄生于植物上，引起多種經濟植物病害，造成田間和產后損失。萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）對鏈格孢有明顯的拮抗作用［11］；解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、放線菌（Actinomycesbovis）、嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）和哈茨木霉（T. harzianum）突變菌株對茄鏈格孢菌均有明顯的抑制效果［12-16］。

本研究從番茄根腐爛病發病嚴重的土壤中分離到一株哈茨木霉菌株，并用該哈茨木霉分別對鏈格孢菌和茄鏈格孢菌進行拮抗實驗，此外，本實驗還對哈茨木霉發酵液中的抑菌成分進行測定，并分析哈茨木霉發酵液對土壤中細菌菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中供試病原菌為鏈格孢菌（Alternaria spp.）和茄鏈格孢菌（Alternaria solani），由中國農業科學院提供，保存于PDA培養基上以備使用；所用土壤為番茄根部腐爛嚴重的土壤，取自山東棗莊某蔬菜大棚。

1.2 方法

1.2.1 哈茨木霉的分離與培養 分離過程：用PDA固體平板培養基對哈茨木霉進行分離，培養基組成：去皮馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 15-20 g、蒸餾水 1 L、pH值自然。分離方法：稱取1 g番茄根部腐爛嚴重的土壤加到盛有100 mL無菌水的燒杯中，攪拌均勻后靜置6 h，取上層土壤浸出液20 μL涂布到PDA固體平板培養基上，28℃恒溫培養箱中培養 5 d，長出肉眼可識別的菌落后，挑取與哈茨木霉形態、顏色、透明度一致的單個菌落重復劃線，直至確認為純菌。

1.2.2 哈茨木霉的系統分類學鑒定 對分離到的菌株進行ITS-PCR擴增，所用引物為通用引物 ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCCG） 和 ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）。擴增體系為：DNA模板 1 μL、2×PCR Master Mix 25 μL、引物 ITS1 和ITS4 各 1 μL、ddH2O 22 μL。擴增條件為 ：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃復性10 min，擴增產物在4℃條件下保存。取5 μL擴增產物與1 μL loading buffer混勻，加入1%瓊脂糖凝膠孔中，用DNA Marker作對照，在1×TAE電泳緩沖液中電泳，以凝膠成像系統檢測PCR擴增產物，委托睿博興科生物技術有限公司測序，測得序列在GenBank中用Blast程序進行相似性分析［17］。用MEGA 5.1進行聚類分析，采用鄰近法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統進化樹［18］。

1.2.3 哈茨木霉發酵液制備 將分離純化出的哈茨木霉菌株接種到PDA固體平板培養基，28℃條件下培養7 d，用無菌水沖洗上述PDA平板，得到孢子懸浮液，將孢子懸浮液加入到發酵培養基中，使其在發酵培養基中濃度為1×107個/mL［19］。發酵培養基組成：葡萄糖 20 g、KH2PO41.2 g、MgSO4·H2O 0.6g、維生素 B10.008 g、蒸餾水 1 L［20］，28℃、120 r/min振蕩培養7 d，得到發酵液。發酵液離心（8000 r/min）10 min取上清液，用0.22 μm的濾頭過濾，得到無菌發酵液，待用。

1.2.4 哈茨木霉發酵液成分的GC-MS分析 發酵液成分的提取步驟：取上述制備好的哈茨木霉發酵液，按發酵液∶乙醇=1∶3（V/V）比例浸提，50℃水浴、攪拌使之溶解，溶解后按溶液∶石油醚=1∶3（V/V）比例浸提，留取水層并分別用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇進一步萃取，對萃取得到的有機層濃縮，再用吐溫-80溶解并分別標志為A、B、C［21］。對A、B、C三種萃取物分別用無水硫酸鈉脫水后用氣質聯用儀（Agilent 5977B）測定。色譜條件：毛細管色譜 柱 HP-5MS（5% Phenyl Methyl Silox，325℃，30 m × 250 μm × 0.25 μm），汽化室溫度 270℃，載氣為氦氣，柱流量1 mL/min，不分流進樣，進樣量為1 μL。60℃柱溫維持 4 min，然后 10℃/min升高到150℃維持2 min，然后以5℃/min升高到260℃維持15 min。進樣口溫度260℃，檢測器溫度280℃。質譜條件：電離源EI，電子能量70 ev，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，掃描范圍全掃描。

1.2.5 哈茨木霉發酵液對土壤中細菌菌群的影響 將10 mL上述1.2.3中制備的哈茨木霉發酵液和10 mL番茄根腐爛病發病嚴重的土壤浸出液（1 g土壤加入到100 mL無菌水，攪拌、靜置而來）接種到200 mL哈茨木霉發酵培養基中，作為實驗組；未接種哈茨木霉發酵液只接種發病土壤浸出液的為對照組，兩種處理均在28℃條件下培養10 d，然后委托上海生工生物工程股份有限公司對兩種處理液進行高通量宏基因組測序。

1.2.6 哈次木霉菌株對兩種供試病原菌的拮抗實驗 采用平板對峙培養法分別對鏈格孢菌、茄鏈格孢菌和上述分離純化到的菌株進行平板對峙實驗，方法：分別挑取直徑7 mm的鏈格孢菌菌塊和茄鏈格孢菌菌塊放置到新的PDA平板一側，距平板邊緣2cm左右的位置上，再將分離純化后的菌塊分別放置到鏈格孢菌菌塊和茄鏈格孢菌菌塊的相對側的PDA平板上，距平板邊緣同樣為2 cm左右的位置，作為實驗組；單獨接種兩種病原菌菌塊的平板作為對照組，培養溫度28℃，培養5 d，每組做3次平行處理，每天記錄病原菌及哈茨木霉的生長狀況，測量菌落半徑。平板培養第5 d時分別計算哈茨木霉對兩種病原菌的抑制率［8，22］。

拮抗系數的分級標準（5級）Ⅰ級：哈茨木霉菌絲長滿平皿；Ⅱ級：2/3平皿面積 ≤ 哈茨木霉菌絲面積 ＜ 100%平皿面積；Ⅲ級：1/3平皿面積 ≤ 哈茨木霉菌絲面積 ＜ 2/3平皿面積；Ⅳ級：0 ＜ 哈茨木霉菌絲面積 ＜ 1/3 平皿面積；Ⅴ級：病原菌菌絲長滿平皿。

抑制率（%）=（病原菌對照菌落半徑-病原菌對峙菌落半徑/病原菌對照菌落半徑）×100%

2 結果

2.1 菌株的菌落形態

菌株在PDA培養基生長迅速，培養3 d時出現白色絮狀菌絲且鋪滿整個平板，之后菌絲逐漸變為綠色，培養6 d時菌絲變為暗綠色，無明顯氣味，菌落形態特征與哈茨木霉菌株基本一致（圖1）。

圖1 菌落的形態觀察

2.2 菌株的系統分類學鑒定

PCR擴增后的DNA序列通過凝膠電泳確認后（長度625 bp）進行測序，將測得的序列在NCBI數據庫中進行BLAST同源性比對，與數據庫中各菌株序列進行相似性分析，與T. harzianumCGAJ1T-1菌株的一致性達100%。用MEGA5.1軟件對同源性較高的序列進行序列分析并構建系統發育樹，系統發育樹如圖2所示，該序列和T. harzianumCGAJ1T-1菌株在同一分支，結合其生物學特性及形態學特征，確定該菌株為哈茨木霉，并命名為Trichoderma harzianumSKD-ZX-1（序列號 ：LC485252）。

2.3 哈茨木霉發酵液抑菌組分分析

用氣相色譜質譜連用儀對提取物A、B、C進行分析［21］，色譜圖如圖3-5所示。得到的質譜圖經NIST02質譜數據庫檢索并與標準圖譜核對，確定其組分。哈茨木霉發酵液提取物的主要化學組分包括醇類、酯類、烷類、烯酸類等，其中化合物名稱及相對含量見表1-3。

由相關研究發現［23］，鄰苯二甲酸酯類具有較好的抑菌效果，而在A和C兩種提取物中均含有鄰苯二甲酸酯類（表1和表3），其中提取物A中鄰苯二甲酸二異丁酯（圖3，7號峰）占出峰總量的5.57%，鄰苯二甲酸二丁酯（圖3，8號峰）占出峰總量的27.33%，鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（圖3，16號峰）占出峰總量的1.6%。提取物C中鄰苯二甲酸二異丁酯（圖5，7號峰）占出峰總量的2.194%，鄰苯二甲酸二丁酯（圖5，9號峰）占出峰總量的1.33%。其他物質是否有抑菌作用還有待研究。

圖2 基于ITS1+ITS4基因序列構建的菌株T. harzianum SKD-ZX-1系統發育樹

圖3 分步提取法提取物A的氣相色譜圖

圖4 分步提取法提取物B的氣相色譜圖

圖5 分步提取法提取物C的氣相色譜圖

2.4 哈茨木霉發酵液對土壤中細菌群落的影響

2.4.1 哈茨木霉發酵液對土壤中細菌菌群多樣性的影響 由表4可知，加入哈茨木霉發酵液的實驗組樣品中含有1505個OTUs，而未加入哈茨木霉發酵液的對照組含有805個OTUs，說明哈茨木霉發酵液可增加土壤中細菌菌群的種類；加入哈茨木霉發酵液的實驗組樣品中Ace和Chao指數均高于對照組，

說明實驗組中細菌物種總數高于對照組；實驗組樣品Shannon指數小于對照組，而Simpson指數大于對照組，說明實驗組樣品中細菌的多樣性低于對照組；實驗組覆蓋度指數微高于對照組，且均在0.90以上，說明采集的樣品足以反應土壤中細菌情況。

表1 分步提取法提取物A的化學成分分析

表2 分步提取法提取物B的化學成分分析

表3 分步提取法提取物C的化學成分分析

2.4.2 哈茨木霉發酵液對土壤細菌菌群結構的影響 通過宏基因組16S rDNA的物種分類分析，得到以下結果（表5、表6）。由表5可知，在門分類水平上，加入哈茨木霉發酵液的實驗組中變形菌門的相對豐度變化較明顯，有明顯的提高，優勢菌群厚壁菌門在實驗組中豐度大大的降低，擬桿菌門和放線菌門變化較小。

表4 各組樣品多樣性指數

由表6可知，在屬分類水平上，腸桿菌屬、假單胞菌屬和梭菌屬3個菌屬的豐度占整體的90%以上。與對照組相比，加入哈茨木霉發酵液組腸桿菌屬提高46%，而假單胞菌屬和梭菌屬分別降低5.28%和36.1%，腸桿菌屬顯著增加，而梭菌屬顯著降低。

2.5 哈茨木霉對兩種供試病原菌的拮抗結果分析

從哈茨木霉和兩種病原菌的對峙實驗中觀察到，哈茨木霉對兩種病原菌均有很好的抑制效果，對峙培養3 d時哈茨木霉和兩種病原菌開始接觸，哈茨木霉在PDA平板上生長迅速，病原菌的生長均明顯受到抑制；5 d時，哈茨木霉已占據整個PDA平板，分別將兩種病原菌包圍，兩種病原菌邊緣塌陷，長勢被削弱，幾乎不再生長（圖6）。根據抑制率公式（1.2.6），分別測量培養5 d時菌落直徑計算出哈茨木霉對鏈格孢菌和茄鏈格孢菌的抑制率均達到100%，拮抗系數為Ⅰ級（表7）。

表5 哈茨木霉發酵液對土壤中細菌在門水平上的豐度影響

表6 哈茨木霉發酵液對土壤中細菌在屬水平上的豐度影響（前10種）

表7 哈茨木霉對鏈格孢菌和茄鏈格孢菌的抑制作用

3 討論

研究表明，哈茨木霉對多種病原菌均有一定的抑制作用。哈茨木霉T28菌株對苗木立枯病3種病原菌，包括立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、德巴利腐霉均有一定的拮抗作用［24］；哈茨木霉TH-1菌株對小麥紋枯病有一定的防治效果，對小麥紋枯病菌菌絲生長有較強的抑制作用［7］；哈茨木霉對番茄灰霉病、枯萎病、葉霉病和褐斑病進行了重寄生［25］。本實驗通過對峙培養，研究了哈茨木霉對鏈格孢菌和茄鏈格孢菌的拮抗作用，其抑制率都相對較高，拮抗系數都達到Ⅰ級，有較好的抑制效果。

圖6 哈茨木霉與兩種致病菌的對峙培養

本研究通過高通量宏基因組測序分析了哈茨木霉發酵液對土壤中細菌菌落的影響，其中腸桿菌屬在加入哈茨木霉發酵液后豐度有大幅度提高，而假單胞菌屬和梭菌屬降低。可見，哈茨木霉發酵液改變了土壤中細菌的菌群結構，并且有相關文獻表明哈茨木霉可以改變土壤中細菌的菌落結構。生防菌哈茨木霉T4促進了假單胞菌、芽孢桿菌、蒼白桿菌和中慢生根瘤菌的生長，對西瓜根圍土壤的細菌群落有了明顯的影響［26］；哈茨木霉T23和土壤有益細菌放線菌、光合細菌和乳酸桿菌分別混合處理后，3種土壤有益細菌的數量均比單獨使用3種供試細菌的數量明顯增加，說明哈茨木霉T23對3種供試細菌有一定的促進生長的作用［27］。對哈茨木霉發酵液進行GC-MS分析后，其中得到醇類、酯類、烷類、烯酸類，有相關的研究表明，鄰苯二甲酸酯類有抑菌、抑藻和他感作用。鄰苯二甲酸二丁酯是一種對藻類具有較強的抑制能力的化感物質，其對短裸甲藻的半效應濃度為1.1 mg/L［28］；辣椒根系分泌物的主要化感物質中有鄰苯二甲酸酯類，其中，鄰苯二甲酸二丁酯的含量最高［29］；廣玉蘭葉片浸提液對銅綠微囊藻有很好的抑制效果，提取物中有大量的抑藻活性物質，其活性成分中有31.69%的鄰苯二甲酸單（2-乙基）己酯；紫莖澤蘭根系分泌化感物質鄰苯二甲酸二丁酯在高濃度下（500，1000 mg/L）對有機磷細菌的生長有抑制作用［30］。以上結果表明，本研究中分離到的哈茨木霉SKD-ZX-1對植物病害土壤中微生物的群體構造具有明顯的影響，但該結果是在實驗室土壤環境條件獲得，與作物實際生長的土壤環境還有一定的差別，包括土壤中溫度、水分、光照等條件都會對哈茨木霉的作用產生一定的影響。因此，田間土壤實驗將是下一步的研究工作。

4 結論

本研究從番茄根腐爛病嚴重的土壤中分離到一株哈茨木霉，并對其生防作用進行研究表明，哈茨木霉SKD-ZX-1對鏈格孢菌和茄鏈格孢菌均有一定的抑制作用；其發酵液含有一定的抑菌成分并且可以改變土壤中細菌的菌落結構。以上結果表明，本研究中分離到的哈茨木霉SKD-ZX-1對植物病害土壤中微生物的群體構造具有明顯的影響，但該結果是在實驗室土壤環境條件獲得，與作物實際生長的土壤環境還有一定的差別，包括土壤中溫度、水分、光照等條件都會對哈茨木霉的作用產生一定的影響。因此，田間土壤實驗將是下一步的研究工作。