內皮祖細胞CXC趨化因子受體7對腦缺血再灌注后血管新生的作用

2019-11-22 06:11:20范加維楊拯王近吳范道貴蔣仕秋曾江華易紅梅戴小珍劉海榮

中國康復理論與實踐 2019年11期

范加維，楊拯，王近吳，范道貴，蔣仕秋，曾江華，易紅梅，戴小珍，劉海榮

1.成都醫學院基礎醫學院，四川成都市 610500；2.成都醫學院生物科學與技術學院，四川成都市 610500；3.成都醫學院第一附屬醫院，四川成都市 610500；4.遂寧市第一人民醫院，四川遂寧市629000

腦卒中是全球導致死亡和殘疾的大血管疾病之一。缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型[1]。干細胞治療已成為治療缺血性損傷的主要策略之一[2]。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一種形成新生血管的前體細胞，能定向分化為內皮細胞[3-4]。組織缺血或內皮損傷后，EPCs 從骨髓動員到外周循環[5-6]，歸巢到血管損傷部位，促進新血管形成和內皮損傷修復[7]。外周血中EPCs數量是內皮功能和心血管疾病風險的標志之一[8-9]，在高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病患者和吸煙者的外周血中，EPCs 數量明顯減少[9]。心血管疾病患者常伴隨高脂、高糖血癥[10-11]，導致外周血EPCs 數量明顯減少。外源性EPCs 移植是治療心腦缺血損傷的重要策略之一。EPCs 移植能縮小腦梗死體積，減輕血管內皮細胞損傷，改善神經功能[12-13]。EPCs 移植也存在許多問題，如移植后EPCs靶向歸巢到缺血組織的能力較差，存活能力低，導致EPCs利用率低，限制了EPCs的臨床應用。

基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)也稱CXCL12，是在中樞神經系統廣泛表達的趨化因子[14]。CXCL12 與其受體趨化因子受體(CXCchemokine receptor,CXCR)4、CXCR7相互作用，在腦缺血損傷修復中發揮重要作用[15-17]。Li等[17]發現，CXCL12 基因治療可顯著改善腦缺血所致白質損傷，促進少突膠質祖細胞向小鼠腦缺血部位遷移，并發現CXCL12/CXCR4的作用主要是促進少突膠質祖細胞的增殖和遷移，而CXCL12/CXCR7 的主要作用是促進少突膠質細胞的成熟。我們前期研究發現[7,18]，EPCs同時表達CXCR4 和CXCR7 兩種受體，兩種受體的作用不盡相同。糖尿病小鼠骨髓來源的EPCs 中，CXCR7 表達明顯下調；上調CXCR7 表達能明顯改善糖尿病下肢缺血[7]。

難以獲得大量自體EPCs 是EPCs 治療缺血性疾病臨床應用面臨的主要困難之一。人臍帶血和臍帶組織可成為EPCs 來源[19-20]；臍帶血和臍帶來源的EPCs 免疫源性較低，異種移植也不會引起免疫排斥反應，能有效改善缺血組織的血管新生[19,21]。我們前期研究發現，CXCR7 在臍帶血來源EPCs 的存活中扮演重要角色，抑制CXCR7 活性將顯著增加EPCs 凋亡。本研究探討上調CXCR7 表達對臍帶血來源EPCs 的存活和血管新生的影響，為臍帶血EPCs 治療缺血性疾病提供更好策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和設備

細胞培養箱、低溫高速離心機、冰凍切片機：美國THERMO 公司。流式細胞儀：美國BD 公司。酶標儀：美國BIOTEK 公司。化學發光儀、梯度PCR 儀、實時定量PCR (real time-PCR,RT-PCR)儀：美國BIORAD 公司。倒置熒光顯微鏡：日本NIKON 公司。正置熒光顯微鏡：德國LEIKA公司。低速多管自動平衡離心機：安徽中科中佳科學儀器公司。

1.1.2 主要試劑

人淋巴細胞分離液Histopaque 1077、人纖維連接蛋白、氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)、SDF-1、FITC-UEA-1：日本SIGMA 公司。EBM-2：美國LONZA 公司。胎牛血清、胰酶：美國GIBCO公司。血管內皮細胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、CD133、CD31抗體：美國CELL SIGNALING TECHNOLOGY 公司。CXCR7：美國ABCAM 公司。Dil-標記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)：美國BIOMEDICAL TECHNOLOGIES 公司。化學發光底物：美國MILLIPORE 公司。iScript cDNA Synthesis Kit、SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix：美國BIO-RAD 公司。基質膠：美國BD 公司。兔抗Actin、山羊抗兔IgG：北京博奧森生物技術有限公司。Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)、Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠IgG (H+L)、DAPI、BCA 蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司。總RNA 提取試劑盒、高效RIPA 組織細胞快速裂解液：北京索萊寶科技有限公司。Annexin v-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒：江蘇凱基生物技術股份有限公司。pLVX-EGFP-3FLAG-Puro載體：上海升博生物技術有限公司。CXCR7、GAPDH 引物：上海生工生物有限公司。水合氯醛：成都市科龍化工試劑廠。氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)：斯百全化學上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的分離和培養

采取人臍帶血20 ml，PBS 等體積稀釋；貼壁緩慢加入盛有等體積Histopaque 1077 的上層，室溫2000 r/min 離心20 min 后，管內液體分為4 層；取中間白膜層細胞，PBS 重懸洗滌2 次，1200 r/min 離心10 min。用添加含多種生長因子的SingleQuots 并加入含10%胎牛血清的內皮細胞基礎培養基EGM-2MV 重懸，將細胞接種于預先用人纖維連接蛋白包被的6 孔板中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱內培養。觀察細胞形態并拍照。待細胞長到80%～90%融合，傳代培養[7,22]。

1.2.2 EPCs的鑒定

1.2.2.1 Dil-ac-LDL攝取和FITC-UEA-1結合實驗

取培養14 d 的細胞，吸棄細胞板內培養液，PBS輕輕洗滌3 次，去除未貼壁細胞。每孔加入10 μg/ml Dil-ac-LDL 200 μl，37 ℃、5%CO2、飽和濕度恒溫孵育4 h；吸棄細胞板中液體，用PBS輕輕洗滌3次，每次5 min；預冷的4%多聚甲醛固定10 min；棄固定液，PBS 洗2 次，每次5 min；加入10 μg/ml FITCUEA-1 200 μl，孵育1 h 后，棄液體；PBS 輕輕洗滌3次，每次5 min；50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下拍照觀察[7]。

1.2.2.2 表面標志物

取培養14 d 細胞，PBS 洗滌，胰酶消化，離心，收集細胞；棄上清，細胞計數，5×104/孔接種至24 孔板。細胞貼壁穩定生長后，PBS洗滌2次，PBS 500 μl中分別加入VEGFR2 和CD133單克隆抗體10 μl，混勻后加入24 孔板中，37 ℃孵育60 min；PBS 洗滌3 次。PBS 500 μl 中分別加入Cy3 和Alexa Fluor 488 熒光二抗5 μl，37 ℃孵育60 min；PBS 洗滌3 次，DAPI 復染；PBS 洗滌3 次，50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.2.3 慢病毒載體的構建及轉染

利用基因重組技術，將人源CXCR7 基因克隆到pLVX-EGFP-3FLAG-Puro 載體，構建CXCR7 過表達載體(pLVX-CXCR7-EGFP-3FLAG-Puro)；采用慢病毒包裝體系，將三質粒系統(pLVX-CXCR7-EGFP-3FLAG-Puro 1.5 μg、pCMV-dR8.9 0.5 μg、pCMVVSV-G 1 μg)共轉染至293T 細胞中，包裝成慢病毒顆粒。轉染36～48 h 后，收集培養液上清，超速離心法濃縮和純化，檢測病毒滴度。

取第4 代EPCs，5×104/孔接種到24 孔板，次日用于病毒感染。細胞分為正常C 組(不感染病毒)、對照C 組(感染pLVX-EGFP-3FLAG-Puro 病毒)和感染C 組(感染pLVX-CXCR7-EGFP-3FLAG-Puro 病毒)。按照MOI=50 加入相應病毒顆粒孵育24 h，更換新鮮培養基。感染72 h后，倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達，將感染率70%以上的細胞用于后續實驗。

1.2.4 CXCR7在EPCs中的表達

1.2.4.1 RT-PCR

轉染72 h 后，收集正常C 組、對照C 組和感染C組EPCs各1×106個，按說明書提取總RNA，采用反轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模版，RT-PCR 檢測各組細胞中CXCR7 mRNA 表達水平(以GAPDH 為內參)，目的基因表達水平用2-ΔΔCt表示。

CXCR7 上游引物序列5'-CGC CTC AGA ACG ATG GAT C-3'，下游引物序列5'-AAC AAG TAA ACC CGT CCC AGA-3'。GAPDH 上游引物序列5'-CAG GAG GCA TTG CTG ATG AT-3'，下游引物序列5'-GAA GGC TGG GGC TCA TTT-3'。

1.2.4.2 Western blotting

轉染72 h后，各組加裂解液抽提蛋白，BCA法蛋白定量。每個樣品取蛋白20 μg，轉膜、封閉，加CXCR7一抗(1∶200)4 ℃孵育過夜；洗膜，加二抗(1∶1000)，37 ℃孵育60 min；洗膜，ECL 試劑盒曝光顯色，Image J 軟件分析各條帶灰度值，以β-actin 為內參計算相對灰度。

1.2.5 基質膠成管試驗

將基質膠用不含生長因子的基礎培養基1∶1 稀釋，100 μl/孔包被48 孔板。4×104/孔分別接種對照C組和感染C 組EPC，每種細胞各分3 組：空白組不添加其他試劑，ox-LDL 組加ox-LDL 50 μg/ml，處理組加ox-LDL 50 μg/ml 和SDF-1 50 μg/ml。37 ℃、5%CO2條件下培養6 h，顯微鏡下觀察管樣結構形成并拍照。Image J軟件計算管樣結構長度[7]。

1.2.6 Annexin v-FITC/PI染色

對照C 組和感染C 組EPCs 分別接種于6 孔板中，每孔1×105個細胞。細胞貼壁后，同前法分為3 組。24 h 后，PBS 洗去未貼壁細胞，不含EDTA 0.25%胰蛋白酶消化收集細胞。根據Annexin v-FITC/PI細胞凋亡試劑盒說明書染色，流式細胞儀檢測AnnexinV+/PI-細胞(早期凋亡細胞)[7]。

1.3 腦缺血再灌注損傷模型的制備

成年Sprague-Dawley 大鼠36 只，體質量(220±20)g，由四川省醫學科學院/四川省人民醫院實驗動物研究所提供，許可證號SCXK(川)2013-15。Longa 線栓法制備大鼠右側腦缺血再灌注損傷模型[23]。

1.4 神經功能評分

再灌注24 h 后，采用Longa 評分標準對大鼠進行神經功能評分。0分，無神經損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側前爪；2 分，向對側轉圈，損傷側出現Horner綜合征；3分，向對側傾倒；4分，不能自發行走，喪失意識；5 分，死亡。0、4、5 分的大鼠舍棄，并補充大鼠[23-24]。于再灌注后7 d和14 d再次評分。

1.5 細胞移植

再灌注24 h 后，造模成功的大鼠等分為PBS 組(n=12)、對照組(n=12)和移植組(n=12)。對照C 組和感染C 組EPCs 重懸于PBS 溶液中，對照組和移植組大鼠尾靜脈輸注對照C 組和感染C 組EPCs 2×106個，體積1 ml，PBS組輸注等體積PBS。

1.6 腦梗死體積檢測

再灌注后14 d，各組取6 只大鼠麻醉，迅速取出腦組織，-20 ℃速凍，均勻切開，2%TTC 37 ℃染色20 min，Image J計算梗死體積[24]。

1.7 GFP陽性細胞計數

其余6 只大鼠取腦組織包埋于OCT 中，制作冰凍切片。各組取一套切片正置熒光顯微鏡下拍照觀察，計算GFP陽性EPCs數。

1.8 免疫熒光染色

各組另取一套冰凍切片，PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 浸洗，山羊血清室溫封閉30 min；加CD31一抗(1∶200) 4 ℃孵育過夜；PBS 浸洗，加熒光標記二抗(1∶500) 37 ℃孵育1 h；PBS 浸洗，含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察，計數區域中毛細血管數。

1.9 統計學分析

采用Origin 7.5 完成實驗數據分析和作圖。結果以()表示，各組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 EPCs的分離培養及鑒定

細胞培養3 d，出現典型的克隆集落樣結構；7 d時集落樣結構逐漸消失，大部分細胞鋪展，呈“鋪路石”樣結構(圖1)。

細胞培養14 d 時，與Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1孵育，在熒光顯微鏡下觀察可見紅色和綠色熒光(圖2)，并表達EPCs 表面標志物VEGFR2 和CD133(圖3)。既能攝取Dil-ac-LDL 又能結合FITC-UEA-1 的棕黃色雙熒光細胞，VEGFR2和CD133雙陽性細胞定義為分化期EPCs。

2.2 EPCs中CXCR7的表達

轉染72 h 后，感染C 組見大量GFP 陽性細胞(圖4)，感染率達70%以上；GFP 蛋白主要分布在細胞膜周邊。

Western-blotting 和RT-PCR 均顯示，感染C 組CXCR7 蛋白和mRNA 表達量明顯高于正常C 組和對照C組(P＜0.01)，后兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表1、表2。

圖1 不同時間EPCs形態變化(倒置顯微鏡，×100)

圖2 Dil-ac-LDL攝取和FITC-UEA-1結合實驗(×200)

圖3 細胞表面標志物VEGFR2和CD133(免疫熒光染色，×400)

圖4 對照C組和感染C組CXCR7表達(倒置熒光顯微鏡，×100)

表1 各組CXCR7蛋白表達(/β-actin)

表2 各組CXCR7 mRNA的表達(2-ΔΔCt)

2.3 基質膠成管試驗和Annexin v-FITC/PI染色

與各自空白組相比，各組ox-LDL 組管樣結構相對長度均明顯下降(P＜0.01)；感染-處理組管樣結構相對長度較對照-處理組顯著延長(P＜0.001)。見圖5、表3。

與各自空白組相比，各組ox-LDL 組EPCs 凋亡率明顯增加(P＜0.01)；感染組顯著低于對照組(P＜0.001)。見圖6、表4。

2.4 腦缺血后神經功能恢復和微血管新生

再灌注后7 d，移植組大鼠Longa評分低于對照組和PBS 組(P＜0.05)；再灌注后14 d，對照組Longa 評分低于PBS 組(P＜0.05)，移植組低于對照組(P＜0.05)。見表5。

再灌注后14 d，對照組腦梗死體積低于PBS 組(P＜0.05)，移植組低于對照組(P＜0.05)。見圖7、表6。

移植組GFP陽性細胞數高于對照組(P＜0.05)，毛細血管數高于對照組(P＜0.05)。見圖8、圖9、表7。

3 討論

本研究顯示，EPCs 轉染CXCR7 后，可顯著增強EPCs 在ox-LDL 作用下管樣結構形成能力和抗凋亡能力；移植轉染CXCR7的EPCs，可促進EPCs歸巢至缺血部位，并促進缺血組織微血管新生。這在一定程度上解決了移植后EPCs 靶向歸巢能力差、存活能力低和利用率低的難題，為干細胞治療缺血性疾病提供了新的方法。

EPCs 是一種新生血管形成的前體細胞，能定向分化為內皮細胞，主要存在于骨髓、外周血和臍帶血中，EPCs 介導的血管新生是治療缺血性疾病的重要策略之一[22,25-27]。由于外周血中EPCs 含量較低，骨髓采集量少，臍帶血成為獲取EPCs 的主要來源。前期研究發現[22]，移植人臍帶血來源的單核細胞到大鼠心肌組織，未出現移植排斥反應。本研究移植人臍帶血來源的EPCs至大鼠體內，也未出現移植排斥反應。

腦中卒患者常伴有高血脂血癥，導致外源性EPCs 存活能力較低，歸巢到缺血部位能力差。SDF-1通過與其受體CXCR4 和CXCR7 結合，在EPCs 的存活、動員和歸巢中發揮重要作用；在應激狀態下，CXCR7 起主導作用[7]。本研究采用ox-LDL 模擬體內高脂血癥環境，發現上調EPCs 中CXCR7 表達能抑制ox-LDL 對EPCs 的損傷，與我們前期研究結果一致[7]。本研究還顯示，移植轉染CXCR7 的EPC 能改善大鼠神經功能，增加缺血部位EPCs數量和毛細血管密度。

Qiu 等[28]發現，骨髓源性EPCs 移植可以減輕腦缺血再灌注損傷，與EPCs 的抗氧化和抗凋亡能力有關。Bai 等[29]發現，EPCs 治療可增加缺血腦組織中腦源性神經營養因子的分泌，從而改善神經功能。本研究進一步證實，移植EPCs 能改善大鼠腦缺血再灌注后神經功能，移植轉染CXCR7的EPCs效果更顯著。