利用小鼠骨骼肌細胞持續表達單鏈胰島素類似物進行1型糖尿病模型鼠的長效基因治療

楊平，蘇若珂，鄧璐，楊月瑤，王剛

(四川大學生物材料工程研究中心，成都610064)

1型糖尿病是由于過度免疫反應導致胰島β細胞被破壞，致使胰島素缺乏，進而引起高血糖和一系列威脅生命的并發癥。該類患者需要每日注射胰島素來維持體內血糖的正常水平，這給患者帶來許多的麻煩、痛苦和風險。基因治療以其簡便、經濟、來源充足、療效持久等優勢引起大眾關注，且以腺病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒、裸質粒等作為臨床試驗中的代表(Yoon &Jun，2002；Handorfetal.，2015)。然而，前三者來源于病毒，存在感染性、容量有限、操作復雜等局限性，而相對安全的裸質粒卻有嚴重的體內轉染效率低下問題。骨骼肌作為基因治療的重要平臺之一，有以下特點：(1)是重要的糖代謝組織，在全身分布廣泛，且肌纖維的使用壽命較長、再生能力較強，即使受損后也能繼續發揮生物學功能(Blaverietal.，1999)；(2)一些哺乳動物的組織，尤其是骨骼肌，能夠自發地吸收不與脂質絡合的外來質粒(Konetal.，1999)；(3)高度血管化的肌肉允許重新合成的蛋白質分泌到體循環中(Kessleretal.，1996；Olfertetal.，2001)。因此，骨骼肌是利用裸質粒作為基因治療載體進行胰島素異位分泌的潛在平臺之一。然而，肌肉、肝臟等組織由于缺乏β細胞特定反應酶而無法直接利用胰島素基因表達出高活性成熟胰島素。因此，本研究首先將胰島素基因序列中的C肽換成靈活的柔性肽linker(GGGGS)3(Kuferetal.，1997)，再使用Pluronic L64-電脈沖體系來提高裸質粒的體內傳遞效率(Liuetal.，2014)，旨在通過這套外源胰島素基因在骨骼肌原位高效傳遞的系統來提高1型糖尿病小鼠的體內基因治療效果，以實現胰島素長期、有效的分泌，進而能為減少患者每日注射胰島素的身心痛苦提供一定的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

從成都達碩實驗動物有限公司[實驗動物生產許可證號：SYXK(川)2015-030]預訂足量6～8周齡雄性BALB/c小鼠，適應性喂養1周，每籠放置6～8只小鼠，并且在濕度45%～65%、21 ℃的環境中飼養，動物房規范提供12 h日照和12 h黑夜環境。所有實驗均得到相關倫理委員會認可，并且按照規定和制度操作[實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2013-07]。所有實驗分為4個組：(1)正常小鼠(NC)組；(2)以pcDNA3.1(+)空質粒為對照的糖尿病小鼠，并且進行Pluronic L64-電脈沖治療，即L/E-pcDNA3.1(+)組；(3)僅使用含單鏈胰島素類似物基因的裸質粒治療組，即pcDNA-INS組；(4)以含單鏈胰島素類似物基因的pcDNA-INS質粒和Pluronic L64-電脈沖進行聯合治療的糖尿病小鼠，即L/E-pcDNA-INS組。空腹血糖水平與生存率最初檢測時以每組12只進行實驗，在單次治療后的4周內進行觀察和檢測，其余指標為每次每組4只進行取樣檢測。

1.2 試劑及儀器

相關試劑材料主要包括：質粒小量提取試劑盒(Omega)、限制性內切酶及相關試劑(Fermentas)、膠回收試劑盒(Omega)、連接酶及相關試劑(Invitrogen)、質粒大量提取試劑盒(Invitrogen)、BCA蛋白含量檢測試劑盒(Thermo)、胰島素ELISA試劑盒(mlbio)、鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma)、血糖檢測試紙(羅氏)、Pluronic L64(Sigma-Aldrich)、相關抗體和染色劑(Cloud-Clone Corp和Abcam)、pcDNA3.1(+)質粒為實驗室前期購買并且保存、含有胰島素類似物基因的質粒PUC57由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成并提供。相關儀器主要包括：凝膠成像系統(ChemiDocTM XRS+，Bio-Rad)，NanoDrop2000(Thermo)、SDZ-Ⅴ型電脈沖治療儀(華佗)、多功能酶標儀(Varioskan Flash，Thermo)、血糖檢測儀(羅氏)、數碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital)。

1.3 實驗方法

1.3.1 質粒的制備與鑒定從NCBI上找到所需胰島素基因序列(NM_008386.4)，分析信號肽、胰島素B鏈、胰島素A鏈、胰島素C肽等各部分的序列，將C肽的序列刪除，替換成柔性肽序列(GGGGS)3，并在兩端加上酶切位點(EcoRⅠ和BamHⅠ)，送成都擎科梓熙生物技術有限公司合成，并構建到PUC57載體上。將空載體pcDNA3.1(+)或PUC57質粒(含胰島素類似物基因)在含氨芐抗生素的平板上活化，進行質粒小提鑒定，再根據設計的酶切位點進行雙酶切，按照說明書步驟進行膠回收、連接反應等操作，構建好含胰島素的載體pcDNA-INS后，將其進行酶切鑒定后測序，確認無誤后對質粒進行大量提取。將所需質粒濃度調至約5 000 ng·μL-1進行分裝，-20 ℃(短期)或-80 ℃(長期)保存。

1.3.2 模型建立及治療STZ放在低溫、干燥、避光環境中保存，按照要求配制1%枸櫞酸緩沖液(pH4.2～4.5)，4 ℃預冷。將小鼠禁食不禁水喂養過夜，并以180～250 mg每公斤體質量一次性腹腔注射STZ溶液，對照組以同樣方式注射不含STZ的等量1%枸櫞酸緩沖液。注射后第3天開始檢測小鼠血糖值，大于16.7 mmol·L-1并且穩定7～14 d則視為糖尿病模型構建成功。治療時，NC組注射等體積的生理鹽水。質粒配制及Pluronic L64-電脈沖體系的使用：以生理鹽水稀釋終濃度0.1%L64與60 μL質粒形成治療混合物，室溫放置5 min，并將小鼠兩側的脛骨前肌脫毛，在兩側等量注射治療混合物，1 h后對小鼠2條腿的脛骨前肌進行電脈沖治療(參數設置為5 Hz，3 min)，單點單次注射，觀察4周左右。

1.3.3 血糖和體質量的檢測采用電子天平和血糖檢測儀分別對小鼠體質量與血糖進行檢測，每次測量血糖之前都將小鼠禁食不禁水過夜處理，次日用羅氏血糖采集針扎出小鼠尾巴的血滴或者用剪尾法采集小鼠血滴。每周至少檢測1次血糖水平。

1.3.4 生存率檢測及小鼠形體觀察從治療當天開始，每日觀察小鼠的外形和生存情況等，記錄每次死亡的小鼠，于第4周實驗結束時對各組小鼠進行拍照記錄。

1.3.5 胰島素檢測(1)胰島素含量檢測：使用眼球摘除術收集小鼠血樣，4 ℃ 3 000 r·min-1離心20 min，仔細收集上清，4 ℃臨時保存，-20 ℃短期保存，-80 ℃長期保存，按照說明書進行胰島素ELISA檢測。(2)胰島素免疫組化檢測：將小鼠引頸法處死后，用解剖剪小心取出胰腺、肌肉等組織器官，用4%多聚甲醛固定液處理后脫水、包埋再切片，切片放入染色缸染色，并且進行抗體孵育，再使用顯色試劑盒處理，洗滌后用蘇木精輕度復染，再封片。最后將制好的樣品在室溫下保存，并且用BA400Digital顯微攝像系統進行結果觀察和圖片采集。

1.3.6 蘇木精-伊紅(HE)染色病理檢測將小鼠引頸法處死后，用解剖剪小心取出心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胰腺及肌肉等所需的組織器官，并將其用預冷后的1×磷酸緩沖液(PBS)洗滌后放入15 mL離心管中，再注入4%多聚甲醛固定液，4 ℃備用。脫水、包埋后切片，將切片放入染色缸進行蘇木精染色，充分洗滌后再用伊紅染液染色，再充分洗滌并且使用中性樹膠封片。最后將制好的樣品在室溫下保存，并且用BA400Digital顯微攝像系統觀察結果和采集圖片。

1.4 統計學分析

使用GraphPad Prism 5.0對數據進行統計學分析，采用Two-Way ANOVA或t檢驗進行分析，以P<0.05表示數據差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 含胰島素類似物基因的載體(pcDNA-INS)構建及結果分析

1.5%瓊脂糖凝膠電泳將構建好的pcDNA-INS質粒進行酶切鑒定，其片段大小為250～500 bp，且完整的pcDNA-INS質粒、pcDNA3.1(+)質粒以及酶切后的pcDNA-INS載體大小和相對位置較為準確(圖1：A)。質粒測序結果顯示其基因序列正確，可以用于后續實驗操作(圖1：B)。

圖1 質粒鑒定及胰島素類似物基因測序Fig.1 Plasmids identification and gene sequence of insulin analogueA.質粒鑒定的電泳結果：M.Marker，1.構建完成的pcDNA-INS質粒載體(未酶切)，2.pcDNA-INS質粒載體雙酶切鑒定，3.pcDNA3.1(+)空載體；B.pcDNA-INS質粒載體上胰島素類似物基因的測序結果A.plasmid identification：M.Marker，1.complete pcDNA-INS plasmid，2.pcDNA-INS plasmid identified by double enzyme digestion，3.pcDNA3.1(+)plasmid；B.gene sequence of insulin analogue on pcDNA-INS plasmid vector

2.2 糖尿病小鼠模型的建立

糖尿病小鼠血糖水平為(24.3±5.74)mmol·L-1，而正常小鼠血糖水平為(4.8±1.01)mmol·L-1，2組間的差異具有統計學意義(t=14.266，P<0.05)。此外，糖尿病小鼠的體質量顯著降低，為(18.67±4.22)g，而正常小鼠的體質量為(22.42±3.06)g，2組間的差異具有統計學意義(t=3.445，P<0.05)。胰腺組織HE染色結果顯示，糖尿病小鼠的胰島細胞遭到了嚴重損害，模型構建結果可靠(圖2)。

2.3 各組小鼠的血糖水平變化

在治療后第3天開始檢測每組小鼠的血糖水平，結果顯示，NC組小鼠保持正常的血糖水平(約5 mmol·L-1)；L/E-pcDNA3.1(+)組小鼠的血糖水平較高，與NC組之間的差異有統計學意義(P<0.05)；pcDNA-INS組小鼠的血糖水平波動較大，與NC組之間的差異有統計學意義(P<0.05)；L/E-pcDNA-INS組的小鼠血糖水平明顯下降，且在第1周后與NC組接近，與其他2組的差異均有統計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖2 正常小鼠(左)與鏈脲佐菌素誘導小鼠(右)的胰腺蘇木精-伊紅染色結果Fig.2 Hematoxylin-eosin staining pancrea results of normal (left)and streptozotocin-induced mice (right)

圖3 各組小鼠治療后的血糖變化Fig.3 Blood glucose trends of mice in different groups after treatments與NC組相比，** P<0.01，*** P<0.001；與L/E-pcDNA-INS組相比，▲▲▲ P<0.001；與L/E-pcDNA3.1(+)組相比，△ P<0.05，△△ P<0.01；下同Compared with normal control group，** P<0.01，*** P<0.001；compared with L/E-pcDNA-INS group，▲▲▲ P<0.001；compared withL/E-pcDNA3.1(+)group，△ P<0.05，△△ P<0.01，△△△ P<0.001；the same below

2.4 各組小鼠的血清胰島素含量變化

實驗開始前，3組糖尿病小鼠血清胰島素水平間的差異無統計學意義(P>0.05)，但是顯著低于NC組(P<0.05)。在治療后第2周，pcDNA-INS組的胰島素水平明顯升高，并且顯著高于L/E-pcDNA3.1(+)組(P<0.05)，與NC組和L/E-pcDNA-INS組之間的差異有統計學意義(P<0.05)，而 L/E-pcDNA-INS組與NC組間的差異無統計學意義(P>0.05)。在治療后第4周，L/E-pcDNA-INS組的胰島素水平雖然降低了一些，但與NC組間的差異無統計學意義(P>0.05)，且與pcDNA-INS組、L/E-pcDNA3.1(+)組間的差異均有統計學意義(P<0.05)。pcDNA-INS組在治療4周后顯著低于 NC組和L/E-pcDNA-INS組，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 各組小鼠治療后的血清胰島素變化Fig.4 Serum insulin contents of mice in different groups after treatments

2.5 糖尿病小鼠生存率情況及免疫組化結果

治療4周內，NC組和L/E-pcDNA-INS組(12/12)的生存率均為100%，L/E-pcDNA3.1(+)組、pcDNA-INS組的生存率分別為50%(6/12)、67%(8/12)，2組間的差異無統計學意義(P>0.05)。其中，L/E-pcDNA3.1(+)組與NC組或L/E-pcDNA-INS組間的差異均有統計學意義(P<0.05)(圖5：A)。在第4周時，取4組小鼠的胰腺和肌肉組織進行免疫組化檢測，發現糖尿病小鼠胰腺均處于受損狀態，且胰腺胰島素含量顯著少于正常小鼠(圖5：B)，而L/E-pcDNA-INS組小鼠骨骼肌胰島素含量明顯高于其他3組(圖5：C)。

圖5 各組小鼠治療后的生存情況(A)及胰腺(B)和肌肉(C)的免疫組化結果Fig.5 Survival condition (A)and immunohistochemical results of pancreas (B)and muscle (C)A：與L/E-pcDNA3.1(+)組相比，☆ NC組，P<0.05，★ L/E-pcDNA-INS組，P<0.05；B，C：1～4.NC組，L/E-pcDNA3.1(+)組，pcDNA-INS組，L/E-pcDNA-INS組；下同A：compared with L/E-pcDNA3.1(+)group，☆ NC group，P<0.05，★ L/E-pcDNA-INS group，P<0.05；B，C：1-4.NC group，L/E-pcDNA3.1(+)group，pcDNA-INS group，L/E-pcDNA-INS group；the same below

2.6 各組小鼠的形體變化及病理檢查結果

治療4周后，L/E-pcDNA-INS組毛色雖有一定暗淡、粗糙現象出現，但脫毛現象較輕，且其整體形態與正常小鼠較為接近(圖6：A1)。L/E-pcDNA3.1(+)組和pcDNA-INS組則有明顯的脫毛現象，且毛色更加粗糙，整體形態更小，肌肉有不同程度的萎縮，且皮膚血管較為明顯(圖6：A2～A4)。此外，HE染色結果顯示，L/E-pcDNA3.1(+)組和pcDNA-INS組小鼠各部位有不同程度的病變，如脾臟組織出現中心淋巴細胞減少且細胞變性壞死現象，肺組織有肺炎及肺泡萎陷現象、肌肉組織發生變性壞死等，而L/E-pcDNA-INS組的組織病變情況明顯較輕，其組織炎癥較少，且肌肉組織沒有明顯壞死，更接近NC組的情況(圖6：B)。

圖6 各組小鼠治療后的形體特征(A)及HE染色結果(B)Fig.6 Appearances (A)and HE staining results (B)of mice after treatment

3 討論

隨著社會、經濟的發展和進步，人們的生活方式和飲食習慣發生了較大變化，導致全球糖尿病患者逐漸增加，預計到2030年，全球糖尿病人數約達到5.22億(Navarro-Gonzalez &Mara-Fernandez，2008；Whitingetal.，2011)。1型糖尿病患者需要每日注射胰島素維持體內血糖的正常水平，這給患者帶來許多痛苦和風險。基因治療能為1型糖尿病患者帶來長期治療效果的福音。目前裸質粒治療雖然安全性較高，但是其體內傳遞效率較低，因此需要將含有胰島素基因的外源質粒有效導入糖尿病生物體內，才能產生良好的治療效果。骨骼肌是重要的糖代謝組織之一，對維持體內血糖平衡起著重要作用，且在全身的分布范圍較廣，比肝臟、胰腺、腎臟等有著更強的操作性和更高的容錯率。因此，骨骼肌是人們理想中外源胰島素基因傳遞的靶場所之一。在自然條件下，胰島素基因轉錄翻譯出的C肽對胰島素的折疊和構象起著至關重要的作用，但其結構冗長且剛性較大，影響胰島素活性的發揮(Abaietal.，1999；Huaetal.，2008)。因此，胰島素原需要在胰島β細胞中經過特定的酶切掉C肽后形成成熟胰島素，進而發揮生理作用。這意味著當外源胰島素基因試圖在非β細胞(如肝臟和肌肉組織)中進行表達時，很難得到高活性的成熟胰島素(Fukazawaetal.，2006；Hanetal.，2011)。為了解決這一難題，可以使用柔性肽linker(GGGGS)3(Kuferetal.，1997)取代C肽，實現胰島素A、B鏈的連接及不需要酶切掉連接區域的雙重目標。

從20世紀開始，人們將電脈沖法應用到與細胞膜通透性改變的相關實驗中，并且取得了一定成效(Coster，1965)。在電脈沖領域的研究中，高、低2種電壓聯用的方法效果較佳。在這種方法中，短時高壓脈沖會促進細胞膜通透性的提升，而相對作用時間較長的低電壓則會使DNA發生電泳現象從而加快入胞速度(Bureauetal.，2000)，但高壓電脈沖可能會對組織造成不可修復的損傷和功能缺陷，而降低電壓則會降低基因傳遞效率(Hartikkaetal.，2001)。因此，人們在不斷探索合適的替代方案來改變細胞膜的通透性，并且抵消高電壓的作用和傷害，普朗尼克非離子型電中性的生物材料，是一類由兩端聚氧乙烯(PEO)組成的親水鏈和中間聚氧丙烯(PPO)組成的親油鏈共同組成的兩親性三嵌段共聚物(Kabanovetal.，2002)。在普朗尼克濃度超過臨界膠束濃度時，其PPO部分可以與親油性材料或藥物結合形成內核部分，而外部的PEO親水鏈部分則可以形成外殼。這時，普朗尼克的結構能夠起到保護內部材料或藥物以及提高整體溶解度的作用(Batrakova &Kabanov，2008)。因此，普朗尼克是一種生物安全性較高、生物相容性較好的生物材料，常用作藥物傳遞載體、藥物乳化劑、緩釋材料等(Alakhovetal.，2001)。

本實驗室的前期研究工作已經構建了一套以L64-電脈沖體系介導的骨骼肌基因傳遞系統。Liu等(2014)在其研究工作中指出L64的加入可以使電脈沖作用下的裸質粒傳遞效率得到顯著提升。He等(2019)將L64-電脈沖體系分別與聚乙烯亞胺(PEI)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)等生物材料聯用，使得裸質粒體內基因傳遞的效率得到進一步提升。Chen等(2015)以細胞系為模型研究了不同濃度L64及L64加入的先后順序對基因傳遞效率的影響機制，并且發現L64主要是具有與細胞膜相似的結構從而擾動細胞膜，提高細胞膜的通透性，促進外源基因的入胞。本實驗室由L64獨特結構對生物膜的影響聯想到了從仿生學角度構建新型三嵌段分子——類磷脂雙分子層結構和反磷脂雙分子層結構，并且研究了2種共聚物的結構和功能特點，以及其對骨骼肌細胞基因傳遞效率的影響和機制(Puetal.，2014)。在外源質粒注射小鼠肌肉組織后，Pluronic L64-電脈沖系統能有效提高外源胰島素基因的有效表達。因此，在成功建立了1型糖尿病小鼠模型后，使用Pluronic L64-電脈沖體系和pcDNA-INS進行聯合治療，糖尿病小鼠血糖得到了有效控制并且其他相關病癥和指標得到了最大的緩解。此外，免疫組化結果顯示，治療4周后，3組糖尿病小鼠的胰腺組織依然受損嚴重，且胰島素表達量較少，而L/E-pcDNA-INS組的肌肉組織含量相對較高，這說明L/E-pcDNA-INS組病癥的緩解并不是由于其被破壞β細胞的重生引起，而確實為外源基因治療效果。HE染色結果表明，長期高血糖對機體的傷害很嚴重，經過治療后的小鼠相對癥狀較輕，尤其以L/E-pcDNA-INS治療方案為代表，在極大程度上緩解了1型糖尿病小鼠的病癥，并且與正常小鼠相比，Pluronic L64-電脈沖體系和pcDNA-INS聯合治療對小鼠的機體沒有明顯毒副作用，是一種較為安全、可靠的、具有潛力的治療方法。

綜上所述，本研究基于實驗室前期工作提供了一套安全、高效的以裸質粒和Pluronic L64-電脈沖體系為基礎的1型糖尿病骨骼肌基因治療系統，為實現胰島素的長期、有效分泌提供了一定實驗依據。