生牛奶中分離大腸桿菌對季銨鹽類消毒劑耐藥性研究

郭莉娟，孫豐慧，張艷嬌 ，劉海鋒，廖小微，代敏*

(1.成都醫學院檢驗醫學院，成都610500；2.成都醫學院，四川省動物源性獸藥殘留防控工程實驗室，成都610500)

大腸桿菌Escherichiacoli可導致腹瀉，感染某些致病性較強的血清型時還可能致命，因此，被很多國家作為各類食品污染狀況的指示菌進行檢測，是保障食品安全的重要指標之一(Nyachuba，2010)。牛奶在人類的日常生活飲食結構中的作用和地位不可替代(Bahareh，2010)，牛奶制品在生產加工過程中極易成為微生物的“繁殖基地”，其中大腸桿菌污染較為常見(Riffonetal.，2001)。因此，在牛奶的生產加工過程中需使用消毒劑(馬保瑞，2013)。

季銨鹽類(quaternary ammonium compounds，QACs)消毒劑是一類高效、低毒的消毒劑，被廣泛應用于養殖、食品加工設備與器皿消毒、環境與物體表面消毒等(張卓娜等，2018)。隨著消毒劑的不合理使用，研究報道多種細菌對QACs消毒劑產生了耐藥性(姜曉冰等，2016；Hanetal.，2019)。目前消毒劑耐藥基因主要有5種染色體型耐藥基因[sugE(c)、emrE、ydgE、ydgF、mdfA](Edgar &Bibi，1997；Bayetal.，2008)，除mdfA基因屬于MFS家族外，sugE(c)、emrE、ydgE和ydgF基因屬于SMR家族；5種可移動原件(質粒、整合子或轉座子)介導的耐藥基因qacE、qacEΔ1、qacF、qacG和sugE(p)屬于SMR家族(Ployetal.，1998；Kuckenetal.，2000；Lietal.，2010；郭莉娟等，2014)。鑒于此，本實驗檢測從奶牛養殖場中分離的牛奶源大腸桿菌對4種QACs消毒劑的最低抑菌濃度(MIC)值，并對10種QACs消毒劑耐藥基因進行檢測，旨在研究大腸桿菌對QACs消毒劑的耐藥現狀，為消毒劑正確使用、預防和控制食源性致病菌QACs耐藥提供理論依據，對保障食品質量安全也具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

第一次從四川省綿陽市某牧場采集生牛奶樣品55個，第二次從四川省成都市青白江區某牧場采集生牛奶樣品19個，2次共采樣74個。樣品采集后裝入冰盒中帶回實驗室24 h內處理完畢。

1.2 儀器與試劑

培養基：緩沖蛋白胨(BPW)、麥康凱(MacConkey broth)、伊紅美藍(EMB)、大豆酪蛋白瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、營養瓊脂(NA)培養基均由北京陸橋技術有限責任公司生產；水解酪蛋白瓊脂(MHA)培養基(Oxoid，英國)。

消毒劑：十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、苯扎氯銨(BC)、雙十烷基二甲基氯化銨(DDAC)(成都貝斯特試劑有限公司)；氯代十六烷基吡啶(CPC)(成都市科龍化工試劑廠)。質控菌株大腸桿菌(ATCC 10536)由四川農業大學資源學院應用微生物學系饋贈。

1.3 引物設計與合成

消毒劑耐藥性基因的10對引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成(表1)。

1.4 菌株的分離

分別取25 mL樣品置于500 mL無菌袋中，加入225 mL BPW，劇烈搖晃；取50 mL加入無菌三角燒瓶中，加入50 mL雙倍麥康凱液體培養基，35 ℃培養24 h。培養完成后，劃線至EMB瓊脂平板上，35 ℃培養24 h。挑選EMB平板上典型大腸桿菌菌落劃線到TSA平板，最后經革蘭氏染色鑒定后，保存至含15%～20%甘油的TSB培養基中，-80 ℃凍存備用(何雪梅等，2014)。大腸桿菌分子鑒定利用16S rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGATACCTTGTTACG-ACTT-3’)進行PCR擴增，并送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序，確定該批牛奶樣品中大腸桿菌的檢出率。

1.5 消毒劑最低抑菌濃度測定

1.5.1 菌懸液與消毒劑平板制備參照藥物敏感性實驗執行標準(Clinical and Laboratory Standards Institute，2017)測定消毒劑的MIC。蘸取大腸桿菌及質控菌株純培養物菌液，劃線于NA培養基上，37 ℃培養過夜，用棉簽蘸取3～5個單菌落加入3 mL 生理鹽水中，充分混勻，制備為0.5麥氏濃度的菌懸液，取200 μL菌懸液加到含有1.8 mL無菌生理鹽水進行10倍稀釋。

表1 季銨鹽類消毒劑耐藥基因引物及序列Table 1 Primers for quaternary ammonium compounds disinfectant resistance genes

采用二倍稀釋法制備消毒劑平板，分別將4種消毒劑稀釋到所需的濃度梯度，然后將不同濃度的消毒劑分別定量(2 mL)加入到平皿中，再向平皿中加入18 mL MHA培養基充分混勻，制成含有不同濃度消毒劑(0.125 mg·L-1、0.25 mg·L-1、0.5 mg·L-1、……、1 024 mg·L-1)的MHA培養基平板。每個濃度3個平行組。

1.5.2 接種培養利用多點接種儀接種，吸取上述操作制備好的菌液1 mL置于接種儀配套的玻璃試管中，按消毒劑濃度從低到高的順序依次放置MHA瓊脂平板，菌液依次接種，每接種點細菌數約為1.5×104CFU。接種完后平板正向靜置約10 min后倒置于恒溫培養箱中，37 ℃培養18～24 h。

1.5.3 MIC值判讀培養完成后，將上述MHA平板放置于暗色且不反光的桌面上，仔細觀察平板上各接種處的菌斑生長情況，以判斷實驗終點。以完全不見某細菌生長所對應的消毒劑濃度MHA平板為該消毒劑對該細菌的MIC，對大腸桿菌消毒劑的MIC值進行統計。

1.6 消毒劑抗性基因檢測

1.6.1 模板制備采用煮沸法制備模板。將無菌棉簽用無菌水潤濕，并輕輕刮取NA培養基上生長的3～5個菌落，使菌落完全掉落在有700 μL無菌水的1.5 mL離心管中，煮沸10 min后，13 000 r·min-12 min，上清液即可作PCR模板(何雪梅等，2014)。

NM360襯板具有如下特點：① 強度高，具有高的屈服強度和抗拉強度，對脆性破壞的抗力也極大。② 韌性高，具有優良的低溫韌性，因此可在大型焊接結構件和低溫環境中使用。③ 優秀的焊接性能，成分設計時極力減低碳含量、碳當量和熱敏感系數，以提高焊接性能，因而具有優秀的焊接接頭性能。④ 優秀的加工性能，鋼板可進行冷加工、彎曲加工和切斷加工。氣體切斷時，即使不預熱也不會出現裂縫。進行預熱加工時，調質鋼需在回火溫度以下加工。⑤ 高超的耐磨損、耐腐蝕性，由于含有鉬、鉻等合金元素，與一般鋼材比較，耐腐蝕性良好，硬度也比較高，耐磨損性也良好。

1.6.2 PCR反應體系與循環條件PCR擴增體系：mix 12.5 μL，10 μmo1·L-1的上、下游引物各1 μL，上述制備的DNA模板2.5 μL，無菌去離子水8 μL，總體積25 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火溫度依照各引物(表1)設定并持續60 s，隨后72 ℃ 90 s，30個循環；最后72 ℃ 10 min。

1.6.3 瓊脂糖凝膠電泳1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳槽中加入0.5×Tris-硼酸電泳緩沖液，電壓100 V，約30 min后取出成像拍照，保存圖片。

1.7 消毒劑耐藥基因與MIC值相關性分析

采用SAS 9.4分析消毒劑耐藥基因與MIC值之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌分離情況

大腸桿菌在麥康凱培養基上的菌落形態為鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，邊緣整齊，表面光滑，在EMB培養基上菌落形態為光滑圓形，有紫色或黑色中心，有金屬光澤的菌落特征。74個牛奶樣品共檢測出45株疑似大腸桿菌，16S rDNA測序結果在NCBI上的BLAST進行序列比對后，最終確認全部為大腸桿菌。該批牛奶樣品中大腸桿菌的檢出率為60.81%(45/74)。

2.2 消毒劑MIC值測定結果

4種消毒劑對45株牛奶源大腸桿菌的MIC值不同，范圍廣泛：CTAB、BC、CPC和DDAC對質控菌株ATCC 10536的MIC值分別為128 mg·L-1、16 mg·L-1、64 mg·L-1、4 mg·L-1(表2)。45株大腸桿菌中，CTAB的MIC值為128～512 mg·L-1，其中MIC值為256 mg·L-1的共34株(75.56%)；BC的MIC值為32～256 mg·L-1，其中MIC值為128 mg·L-1的共32株(71.11%)；CPC的MIC值為32～256 mg·L-1，其中MIC值為128 mg·L-1的共18株(40.00%)；DDAC的MIC值為16～128 mg·L-1，其中MIC值為32 mg·L-1的共35株(77.78%)。本次檢測中，45株牛奶源大腸桿菌對CTAB、BC及CPC的抑制50%受試菌生長所需MIC值(MIC50)和抑制90%受試菌生長所需MIC值(MIC90)均達到128 mg·L-1以上，且對DDAC更敏感，其MIC50和MIC90分別達到32 mg·L-1和64 mg·L-1(表3)。

2.3 消毒劑耐藥基因檢測結果

2.3.1 消毒劑耐藥基因檢出率45株牛奶源大腸桿菌中全部檢出攜帶消毒劑耐藥基因，染色體型耐藥基因檢出率(37.78%～84.44%)均高于質粒型耐藥基因(4.44%～33.33%)。其中，基因ydgF(n=38，84.44%)和ydgE(n=36，80.00%)的檢出率最高，基因sugE(p)(n=2，4.44%)、qacG(n=5，11.11%)和qacF(n=6，13.33%)的檢出率較低(圖1)。

表2 大腸桿菌對不同消毒劑的最低抑菌濃度值分布Table 2 Minimum inhibitory concentrations of quaternary ammonium compounds disinfectants on Escherichia coli

表3 大腸桿菌對4種季銨鹽類消毒劑的耐受程度Table 3 The tolerance of Escherichia coli to 4 quaternary ammonium compounds disinfectants

圖1 45株大腸桿菌消毒劑耐藥基因檢測Fig.1 Detection of disinfectant resistant genes in 45 Escherichia coli isolates

2.3.2 消毒劑耐藥基因組合根據大腸桿菌攜帶消毒劑耐藥基因的不同，將45株大腸桿菌攜帶的消毒劑耐藥基因分為33種不同組合(表4)，耐藥基因組合最少的有1種，最多的共8種，檢測出3種及3種以上的耐藥基因菌株有37株，占82.22%。檢出耐藥基因組合占比為2.22%～8.89%，其中，檢出耐藥基因菌株數最多的組合為ydgE-ydgF-sugE(c)(n=4，8.89%)，其次為mdfA-ydgE-ydgF-sugE(c)(n=3，6.67%)和mdfA-ydgE-ydgF-emrE-sugE(c)(n=3，6.67%)。檢出耐藥基因菌株數最多的組合中的4種菌株對5種消毒劑的MIC值均高于標準菌株，并顯示出對這5種消毒劑為較高水平耐藥。

2.4 消毒劑耐藥基因與MIC值相關性

相關性分析發現，大腸桿菌消毒劑基因qacF與128 mg·L-1的CPC之間的差異有統計學意義(P<0.05)；未發現其他耐藥基因與MIC值之間差異性。但分析消毒劑耐藥基因組合與MIC值之間的關系發現，耐藥基因組合為5種及5種以上的大腸桿菌中，CTAB的MIC90為512 mg·L-1的菌株占31.25%(5/16)；耐藥基因組合為4種及4種以上的菌株中，CPC的MIC90為256 mg·L-1的菌株占29.63%(8/27)。

表4 45株大腸桿菌中消毒劑耐藥基因分布情況Table 4 Distribution of disinfectant resistant genes in 45 Escherichia coli isolates

3 討論

3.1 牛奶中大腸桿菌污染情況

本研究中45株大腸桿菌均分離于牧場健康奶牛牛奶樣品，分離率為60.81%。Ombarak等(2016)調查埃及被大腸桿菌污染原料乳及其產品中獲得了222株大腸桿菌，而其他喜食牛奶的國家也曾不同程度地爆發過受致病菌污染而導致的牛奶源疾病(馮疆蓉，李春杰，2016)。付宇等(2016)在采集的110份牛奶樣品中共分離出大腸桿菌59株，檢出率為53.6%(59/110)。黃夢夏等(2018)采集牛奶樣本26份，鑒定出大腸桿菌6株，檢出率為23.1%(6/26)。牛春暉等(2018)從采集牛奶樣本中獲得的大腸桿菌分離率高達100%。一般情況下，牛奶中大腸桿菌主要來源于患病泌乳牛病原菌的感染，這與奶牛生活環境及擠奶室環境有很大關系(馮疆蓉，2017)。

3.2 牛奶中大腸桿菌對消毒劑的耐藥性

45株大腸桿菌對4種消毒劑的MIC值檢測結果均不相同，其中，CTAB的MIC值最高(128～512 mg·L-1)，明顯高于其他3種消毒劑，這與Schwaiger等(2014)對腸球菌Enterococcus的季銨鹽類消毒劑耐藥性研究的結果一致。目前對于細菌對消毒劑耐藥性的判定依據尚無定論。較多研究者以藥物敏感性實驗實際測得的菌株MIC值與所用標準菌株在相同環境下的MIC值比較來判定該菌株的耐藥性(常帥，2013)。某細菌在消毒劑作用下的MIC值超過標準菌株時，則認為該細菌對該消毒劑具有耐藥性。本研究中大腸桿菌對BC和DDAC的MIC值均高于質控標準菌株，少數菌株對CTAB和CPC的MIC值與標準菌株的相同，但多數菌株對這2種消毒劑的MIC值仍較高。另外，大腸桿菌對研究中4種消毒劑的MIC50和MIC90都較高，其中，CTAB、BC和CPC的MIC50和MIC90均在128 mg·L-1以上。由此可見，與抗生素濫用后造成的影響一樣，消毒劑的廣泛使用也會對大腸桿菌產生選擇作用，造成大腸桿菌的耐藥性。何雪梅等(2014)對豬肉源大腸桿菌消毒劑的耐藥性研究表明，大腸桿菌對QACs消毒劑的MIC值普遍較高，且比標準菌株的有明顯升高，與本實驗結果一致。

大腸桿菌消毒劑耐藥性產生的原因主要是消毒劑的使用劑量不足，以及不科學的使用范圍。大量動物源細菌耐藥性的研究發現，細菌的耐藥率與養殖場抗菌藥的使用劑量、頻率存在很強的相關性(潘志明等，2002；宋立等，2009)。不合理的操作使消毒劑對其原本可以殺滅的細菌不能起到殺滅作用，當長期處于這種無效藥物作用的環境下，便強化了細菌對該類藥物的適應性，從而增加了消毒劑耐藥性的產生概率。

3.3 牛奶中大腸桿菌消毒劑耐藥基因情況

本研究的消毒劑抗性基因包括mdfA、ydgE/F、emrE和sugE(c)5種染色體編碼基因，以及qacE、qacF、qacEΔ1、qacG和sugE(p)5種質粒介導的抗性基因。這些染色體編碼基因能特異性地介導對QACs消毒劑的耐藥性，且研究表明它們可以在大腸桿菌中垂直傳播(Bay &Turner，2009)。同樣，當環境中擁有質粒、整合子或者轉座子等可移動元件介導的抗性基因，如qacE、qacEΔ1等，細菌就有可能通過可移動元件獲得這些抗性基因，從而增加該環境中細菌消毒劑抗性基因的攜帶率。目前已有報道的消毒劑抗性基因除上述10種外，還有很多屬于qac家族亞型的基因，比如qacA、qacB、qacC、qacH和qacI等，其中已有研究在大腸桿菌等革蘭氏陰性細菌中發現qacH、qacI基因(Polyetal.，1998；Kuckenetal.，2000；Lietal.，2010)。這些抗性基因中只有mdfA基因屬于MFS家族，其余基因均通過編碼外排泵蛋白賦予對QACs消毒劑的耐藥性，因而均在SMR蛋白家族中(Bayetal.，2008)。趙凱麗和李武平(2016)在研究微生物消毒劑抗性產生機制時發現，大腸桿菌可以利用外排泵增加消毒劑向胞外的主動排出從而對消毒劑產生抗性，對大腸桿菌所含抗性基因進行檢測顯示，無論是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌中均有外排泵基因檢出的情況。Smith等(2008)發現，qac家族基因檢出的陽性菌株與陰性菌株對QACs消毒劑的MICs存在顯著差異，其中攜帶qac家族基因菌株的MIC值可為不攜帶該家族基因的2倍。

本研究所檢測的10種消毒劑抗性基因均為陽性，消毒劑染色體型耐藥基因檢出率(37.78%～84.44%)較質粒型耐藥基因檢出率(4.44%～33.33%)高，基因ydgF(n=38，84.44%)和ydgE(n=36，80.00%)最高。同時，質粒型耐藥基因中檢出率最高的是qacEΔ1(n=15，33.33%)，其次是qacE(n=8，17.78%)。qacEΔ1基因為qacE基因的缺失型，本研究中牛奶源大腸桿菌中qacEΔ1基因檢出率較其他質粒型基因高。宋紅梅等(2013)對生活用水中總大腸菌群中耐藥基因研究中，大腸桿菌qacEΔ1基因檢出率(45.5%)也較高。由此可見，qacEΔ1基因很可能在細菌之間廣泛傳播，應當引起重視。

本研究所檢測的耐藥基因在45株牛奶源大腸桿菌中均被檢出，且耐藥基因組合較豐富(共檢出33種)，且檢測基因組合越多，菌株的MIC值越高。說明牛奶源大腸桿菌攜帶消毒劑抗性基因的概率很高。嚴重的是，某些細菌由于長期暴露在QACs消毒劑亞抑菌濃度下，不僅產生對消毒劑的耐藥性，還可能出現傳播時交叉耐藥現象，比如可能導致消毒劑與抗生素產生共耐藥機制(Soumetetal.，2012；楊盛智等，2016)，給臨床疾病治療上抗生素的使用帶來更大的挑戰。