大腸癌中自噬相關蛋白與JAK2/STAT3信號通路的相關性

（嘉興市第二醫院 腫瘤外科，浙江 嘉興 314000）

細胞自噬是真核生物普遍存在的一種自穩機制，在細胞自我保護、胚胎發育及生物生存等機體正常生理機制中發揮關鍵作用。自噬失調與腫瘤的發生、發展關系密切[1]，近年來大量研究表明自噬參與大腸癌的發生、發展，但其具體機制尚不明確[2-3]。JAK2/STAT3信號通路在大腸癌的增殖、凋亡及侵襲轉移等過程中均發揮重要作用[4]。本文通過研究自噬相關蛋白與JAK2/STAT3信號通路在大腸癌中的相關性，為探索大腸癌的發病機制提供新的實驗數據和理論基礎。

1 資料與方法

1.1 資料

收集2015年7月-2016年12月嘉興市第二醫院腫瘤外科大腸癌患者手術切除標本93例。根據2010年WHO消化系統腫瘤分類標準[5]，患者均經病理學專家檢查確認。其中，男性51例，女性42例；年齡25～83歲，平均（62.18±6.39）歲；腫瘤直徑≥5 cm 59例，＜5 cm 34例；發病部位：結腸38例，直腸55例；腫瘤分化程度：高分化29例，中分化46例，低分化18例；組織類型：管狀腺癌78例，黏液腺癌15例；浸潤深度：黏膜及黏膜下層3例，肌層11例，外膜79例；有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移68例。大腸癌標本和癌旁組織標本取材分別在癌灶中央的非壞死區和遠離癌組織5 cm的區域，經過4%多聚甲醛溶液固定24 h，采用免疫組織化學法檢測。患者均為首次發現，患者術前未行任何放化療、靶向治療等抗腫瘤治療。

1.2 試劑

兔抗人LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3均購自美國Cell Signal Technology公司，免疫組織化學試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學法檢測采取免疫組織化學法檢測LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3在大腸癌組織，以及癌旁組織中的表達，具體步驟如下：脫蠟水化，梯度酒精水化，3%過氧化氫H202孵育15 min，PBS沖洗3次，放入pH值6.0的拘椽酸鈉緩沖液中，在100℃高壓鍋內1 min暴露抗原，PBS沖洗3次，添加適量聚合物輔助劑孵育20 min，PBS沖洗3次，DAB試劑盒顯色，充分清洗，蘇木精復染，自來水沖洗，鹽酸酒精分化1 s，自來水沖洗，氨水返藍，自來水沖洗，二甲苯處理3次，中性樹膠封片。

1.3.2 結果判定LC3、p62及p-JAK2陽性著色部位位于細胞質，在每張切片上隨機選取10個高倍視野（400倍），每個視野計數100個細胞，根據細胞染色強度及陽性細胞比例進行結果判斷。著色強度：不著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，黃褐色計3分；陽性細胞比例≤5%計0分，＞5%～25%計1分，＞25%～50%計2分，＞50%～75%計3分，＞75%計4分。將著色強度與陽性細胞比例評分乘積作為最終評分結果，≥4分為陽性表達，＜4分為陰性表達。p-STAT3陽性著色位于細胞核，以細胞核呈棕黃色為陽性標志，計算陽性細胞占腫瘤細胞百分比，將陽性細胞百分比≥50%作為高表達組，＜50%作為低表達組。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，相關分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中LC3、p62的表達及其與大腸癌臨床病理特征的關系

LC3和p62主要表達于細胞質中，為黃褐色或棕褐色顆粒（見圖1），大腸癌與癌旁組織中LC3陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），大腸癌高于癌旁組織。不同分化程度LC3陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），高、中分化低于低分化。有無淋巴結轉移患者LC3陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移。見表1、2。

大腸癌與癌旁組織p62陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），大腸癌組織低于癌旁組織。不同分化程度患者p62陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），高、中分化高于低分化。有無淋巴結轉移患者p62陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），有淋巴結轉移低于無淋巴結轉移。LC3、p62表達情況與患者性別、年齡、腫瘤直徑及腫瘤部位無關（P＞0.05）。見 1、2。

圖1 大腸癌及其癌旁組織中自噬相關蛋白和STAT3信號通路的表達 （免疫組織化學×400）

2.2 不同組織中JAK/STAT3通路相關分子的表達及其與大腸癌臨床病理特征的關系

p-JAK2陽性表達染色主要定位于細胞漿（見圖1）。大腸癌與癌旁組織p-JAK2陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），大腸癌高于癌旁組織。p-JAK2的表達與患者的年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤部位無關（P＞0.05）。不同分化程度患者p-JAK2陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），高、中分化低于低分化。有無淋巴結轉移患者p-JAK2陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移。見表1、2。

p-STAT3陽性表達染色主要定位于細胞核和細胞漿（見圖1）。大腸癌與癌旁組織中p-STAT3陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），大腸癌高于癌旁組織。p-STAT3的表達與患者的年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤部位無關（P＞0.05）。不同分化程度p-JAK2陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），高中分化低于低分化。有無淋巴結轉移患者p-JAK2陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移。見表2。

表1 大腸癌與癌旁組織的LC3、p62、p-JAK2及p-STAT3陽性率比較 [n =93，例（%）]

表2 不同因素大腸癌患者LC3、p62、p-JAK2和p-STAT3陽性率比較 例（%）

續表2

2.3 自噬相關蛋白與JAK2/STAT3信號通路的相關性

大腸癌中自噬相關蛋白LC3的表達與p-JAK2、p-STAT3的表達均呈正相關（rs=0.315和0.295，P=0.001和0.003）， 而p62的表達 與p-JAK2、p-STAT3的表達均呈負相關（rs=-0.320和-0.326，均P=0.001）。見表3。

表3 LC3、p62與p-JAK2、p-STAT3蛋白表達的相關性 例

3 討論

自噬與多種疾病的發生、發展有關，其在腫瘤發展中的作用也越來越受到重視。微管相關蛋白1輕鏈3作為哺乳動物自噬體形成，以及胞漿到空泡靶向囊泡所必需的一種蛋白，常用來作為自噬體的標志性蛋白之一，微管相關蛋白1輕鏈3表達情況可在某些程度上反映自噬體數量[6]。自噬過程中，p62蛋白與待降解蛋白結合，并包裹到自噬體中，然后被特異性降解，因此p62蛋白的表達與自噬活性呈負相關。本研究結果顯示大腸癌中LC3陽性表達率明顯高于癌旁組織，而p62在大腸癌中的陽性表達率明顯低于癌旁組織，且隨著癌組織的分化程度越低，LC3陽性表達升高而p62陽性表達率降低。表明大腸癌組織中的自噬水平明顯高于癌旁組織，且自噬水平與癌組織的分化程度和淋巴結轉移有關，組織分化程度越低，自噬水平越高；且出現淋巴結轉移患者自噬水平明顯高于無淋巴結轉移，這與文獻報道的研究結果相一致[7]。

JAK2-STAT3信號通路在細胞增殖、生長、分化及凋亡過程中發揮重要作用，是一條與多種腫瘤的形成和發展關系密切的信號通路[8-12]。有研究表明，JAK2/STAT3信號通路在大腸癌的發生、發展中發揮著重要作用[13]。本研究發現，p-JAK2和p-STAT3在大腸癌中的陽性表達率高于癌旁組織，且與組織分化程度與淋巴結轉移有關，p-JAK2和p-STAT3在高、中分化癌組織中的陽性表達率低于低分化癌組織，在有淋巴結轉移癌組織中的陽性表達率高于無淋巴結轉移的癌組織，表明JAK2-STAT3信號通路的高表達可能與大腸癌的惡性程度有關，這些結果與文獻報道相一致[14]。

多項研究結果表明，JAK2/STAT3信號通路與癌細胞的凋亡密切相關[15-17]。多種腫瘤中發現，敲除JAK2可誘導細胞凋亡和自噬[18-20]。因此推測，大腸癌中自噬相關蛋白與JAK2/STAT3信號通路可能存在關聯。本研究通過相關性分析發現，大腸癌組織中LC3的表達與p-JAK2和p-STAT3的表達均呈正相關，p62的表達與p-JAK2和p-STAT3的表達均呈負相關。提示大腸癌中自噬活性的升高與JAK2/STAT3信號通路密切相關。

綜上所述，在大腸癌的發生、發展中，自噬相關蛋白與JAK2/STAT3信號通路通過內在的分子機制相互協調轉化，使細胞向惡性方向發展。因此，對兩者的深入研究有利于揭示大腸癌發生、發展過程中的分子機制，為早期發現、治療大腸癌提供新的理論依據。后續研究需進一步擴大樣本量，以獲得更為可靠的研究數據。