DNA-蛋白質交聯的研究進展

黃康敏

摘要?DNA-蛋白質交聯（DNA?protein crosslinks，DPCs）是一種高毒性的DNA損傷，由紫外線、電離輻射以及甲醛等化合物誘導形成。DPCs會阻礙DNA復制，造成DNA雙鏈缺口，影響基因組的穩定性。目前，研究發現酵母的蛋白酶Wss1和后生動物的蛋白酶SPRTN通過蛋白水解作用參與了DPCs的修復途徑，為闡明DPCs的修復機制奠定了基礎。對DPCs的影響因素及修復途徑進行總結，為DPCs的深入研究提供了一些思路。

關鍵詞?DNA-蛋白質交聯;DNA修復;Wss1;SPRTN

中圖分類號?R114文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）20-0018-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.005

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research Progress of DNA?Protein Crosslinks

HUANG Kang?min?（Guizhou Center for Disease Control and Prevention，Guiyang，Guizhou 550000）

Abstract?DNA?protein crosslinks（DPCs） are highly toxic DNA lesions，DPCs arise by UV?light，ionizing irradiation，are particularly caused by reactive compounds such as formaldehyde.DPCs interfere with DNA replication and transcription，which could result in double strain break （DSB），and affect the stability of genome.It was found that the metalloproteinase Wss1 of yeast and the protease SPRTN of metazoan participated in the DPCs repair through proteolysis，laying a foundation for elucidation of the mechanism of DPCs repair.This review summarized the influencing factors and pathway of DPCs repair，and provided some ideas for further research on DPCs.

Key words?DNA?protein crosslinks;DNA repair;Wss1;SPRTN

在細胞的生命活動中，各種外源性和內源性因子（如紫外線、活性氧等）會造成DNA損傷，從而導致突變、癌變，甚至死亡[1]。為了維持基因組的穩定性，機體激活DNA損傷應答（DNA damage response，DDR）和DNA損傷耐受機制，處理DNA損傷。DDR具有特異性，能夠識別和修復不同的DNA損傷[2-3]。目前已了解多種DDR途徑，但DNA-蛋白質交聯（DPCs）的具體修復途徑尚不明確。

蛋白水解功能參與了DPCs的修復過程[4]，并且后生動物的蛋白酶SPRTN也幫助修復。DPCs是一種特殊類型的DNA損傷，是由拓撲異構酶或者其他蛋白質共價結合DNA形成的交聯物。DPCs由紫外線、電離輻射、甲醛等造成，若不及時修復，會阻礙DNA復制和轉錄，導致基因組的不穩定性，甚至是細胞死亡[5]。 目前，研究發現酵母的蛋白酶Wss1通過DPCs[6]。該研究對DPCs的種類、影響因素以及修復途徑進行綜述，為DPCs的深入研究提供一些思路。

1?DNA-蛋白質交聯的形成

DPCs分為酶型DPCs和非酶型DPCs。酶型DPCs是暫時性結合的酶-DNA復合物受藥物等影響后形成的長期性交聯的復合物。非酶型DPCs是蛋白質與DNA在內源性或外源性因子的作用下形成的非特異性交聯。

1.1?酶型DPCs

細胞正常的生命活動中有大量的酶促反應，某些酶與DNA形成暫時的共價復合物，發揮相應的功能后，能從DNA上解離。然而，酶與DNA結合的共價復合物遇到DNA損傷或者某些藥物時，酶不能從DNA上解離，形成了由酶與DNA共價結合的DNA-蛋白質交聯，即酶型DPCs[7]。

拓撲異構酶1（Top1）是一種松弛DNA超螺旋的酶。Top1催化DNA雙鏈中的一條鏈斷裂，產生的單鏈缺口允許DNA鏈旋轉，進而釋放DNA的扭轉張力。在松弛DNA超螺旋的過程中，Top1共價連接DNA，形成了拓撲異構酶1分離復合物（Top1 cleavage complex，Top1cc）。松弛超螺旋的任務完成后，Top1重新連接單鏈缺口[8-9]。然而在DNA損傷（如堿基缺失、錯配）的作用下，阻礙了單鏈缺口的重新連接，導致Top1與DNA持續性地共價結合，形成了酶型DPC[10]。除DNA損傷的影響之外，抗癌藥物喜樹堿（camptothecin，CPT）等能夠限制Top1cc，使其成為酶型DPC[11-12]。CPT是Top1的抑制劑，CPT或類似CPT的小分子藥物能夠插入到Top1與DNA結合的交界，限制Top1cc，阻礙單鏈缺口的重新連接[11]。單鏈缺口易轉變為雙鏈缺口，會導致遺傳信息缺失、基因組重排，甚至是細胞死亡，因此Top1形成的酶型DPC是一種較危險的DNA損傷。

拓撲異構酶2（Top2）不僅能松弛DNA超螺旋，還能促進DNA形成超螺旋。Top2也能與DNA共價結合，形成酶型DPC。抗癌藥物依托泊苷（etoposide）是Top2的抑制劑，能夠導致Top2與DNA共價交聯形成酶型DPC[7]。

研究發現其他的DNA修復酶也形成了酶型DPCs。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）是一種負責從DNA中去除烷基加合物的酶，當細胞被氮芥或致癌物質1，2，3，4-二環氧丁烷處理時，MGMT與DNA共價結合形成DPCs[13-15]。聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶-1 （PARP-1）參與多種DNA修復、DNA損傷檢測和染色質重構過程，已被證明在堿基切除修復過程中與DNA共價結合，形成DPC[16]。化療藥物5-AzadC是甲基轉移酶抑制劑，能夠誘導DNA甲基轉移酶（DNMTs）與DNA共價交聯[17]。

1.2?非酶型DPCs

不同于酶型DPCs，非酶型DPCs的交聯蛋白不具有特異性。根據來源的不同，將誘導DPC的活性分子分為內源性和外源性因子。

1.2.1?內源性因子。細胞代謝過程會產生一些具有活性的副產物，如甲醛、乙醛等活性醛類。這些內源性的活性分子能夠誘導蛋白質與DNA發生交聯。

甲醛是組蛋白去甲基化過程中的一種中間產物[18]。研究發現甲醛具有遺傳毒性和致突變性，可以導致DNA鏈斷裂、DNA-DNA交聯以及DPCs[19]。甲醛是交聯蛋白質與DNA的有效分子，在染色體免疫沉淀（ChIP）試驗中被應用于分離DNA-蛋白質復合物。甲醛所致的DPCs是通過甲醛與氨基酸側鏈和DNA堿基的游離氨基或亞胺基團反應形成席夫堿[20-21]。

乙醛是乙醇脫氫酶（ADH）氧化乙醇的代謝產物，乙醛會引起多種DNA損傷，其中包括DPCs。研究發現缺乏乙醛脫氫酶2（ALDH2）會導致乙醛在體內聚積，引起DNA損傷。最終DNA損傷的積累引發了惡性腫瘤，以及細胞的自身降解[22-23]。

1.2.2?外源性因子。

在外界環境中存在多種不同的DPCs誘導劑。DPCs可被離子輻射、紫外線、抗癌藥物和重金屬（如鉻、鎳）等誘導形成[24]。許多其他致癌物質也可以誘導DPCs，其中包括烷化劑，如1，3-丁二烯、二環氧丁烷、丙烯醛和巴角醛[25-28]。

離子輻射能產生較高水平的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS會引發多種類型的DNA損傷，其中包括DNA單鏈缺口、DNA堿基缺失、DPCs等[29]。DPCs也受紫外線誘導[30]，其機制不完全清楚，可能是紫外線誘導的ROS調控了DPCs的形成[31]。此外，一些抗腫瘤藥物（如順鉑及其衍生物、絲裂霉素C等）也會誘導DPCs[32-33]。

多種環境反應的產物也會引起DPCs，如煙草煙霧中存在的二環氧丁烷（DEB）等[34]。此外，活性氮也能引發DPCs，比如一氧化氮（NO）。DNA暴露于NO環境中造成鳥嘌呤脫氮生成新堿基——奧沙寧（Oxanine）。Oxanine能與賴氨酸和精氨酸的氨基反應，有效誘導DPCs[35-36]。

2?DNA-蛋白質交聯的修復

DPCs具有一定的危害性，干擾了DNA的相關活動。例如，DPCs阻礙解旋酶對DNA雙螺旋的解旋作用，造成DNA復制的停滯，最終阻礙了細胞分裂。DPCs還會引發雙鏈缺口等其他類型的DNA損傷，甚至是細胞死亡。因此，DPCs的修復對于維持基因組的穩定性具有重要作用。

2.1?蛋白酶體參與DPCs的修復

CPT誘導Top1與DNA形成酶型DPCs。研究發現該DPC損傷的修復是通過蛋白酶體的降解途徑[37]。首先，修復起始是降解Top1。Top1通過蛋白酶體途徑降解后，從DNA上解離。然而DNA上仍保留一些小的肽片段。然后，殘余的小肽被酪氨酰-DNA磷酸二酯酶1（Tdp1）催化水解，從DNA上被移去[38]。Tdp1能夠催化水解Top1的酪氨酸殘基與DNA的3末端之間的化學鍵[39]。此外，研究發現蛋白酶體能夠直接降解DPCs的蛋白質，隨后DNA上未完全降解的小肽再通過核酸切除修復切除，使受損的DNA恢復到正常狀態[40]。

2.2?蛋白酶Wss1/SPRTN參與DPCs的修復

DPCs的修復可以通過蛋白質水解途徑進行。研究發現在芽殖酵母、后生動物等系統中存在DPC特異性的蛋白酶，DPCs的蛋白質被蛋白酶水解為小肽，轉變為較小的DPCs，再由其他修復通路進行調控[4，41]。前導鏈上的DPC阻礙了解旋酶催化DNA雙鏈解旋，DPC的蛋白質被蛋白酶（如Wss1或SPRTN）水解為小肽。然后，跨損傷合成的DNA聚合酶（translesion synthesis polymerase）忽略殘余的損傷進行復制，但會導致單堿基突變。DNA復制完成后，核酸切除修復（NER）能夠切除殘余的DNA損傷[40，42]。

Wss1是酵母中的一種金屬蛋白酶，其蛋白酶活性能被DNA活化，作用于與DNA結合的蛋白質，使蛋白質水解[4，43-44]。研究顯示酵母細胞在甲醛的作用下，敲除WSS1基因會導致DPCs積累和總染色體重排率上升[4]。蛋白酶Wss1能夠作用于由甲醛誘發的非酶型DPC以及CPT引發的酶型DPC，通過水解蛋白質來修復DPCs，促進損傷DNA的正常復制和維持基因組的整合性[4]。在DNA復制過程中，當前進的復制叉受到DPCs的阻礙，復制叉被迫停滯。此時，蛋白酶Wss1結合DNA，水解DPCs的蛋白質，幫助重啟DNA復制[4]。因此，Wss1與DPCs的修復密切相關，幫助包含DPCs損傷的DNA順利完成DNA復制。

Wss1的N端包括了WLM、SHP和VIM基序，C端含有2個SIM基序，研究發現SHP和VIM基序的突變影響Wss1對DPCs的修復[4]。Wss1通過N端的SHP、VIM基序結合分離酶Cdc48的N端形成復合物，Cdc48協助Wss1結合并水解SUMO修飾的蛋白質[44-45]。此外，Wss1通過C端的2個SIM基序結合SUMO分子。蘇木化修飾與DNA修復密切相關，如HR修復DNA雙鏈缺口的過程中涉及相關蛋白的蘇木化修飾[46]。在DPCs的調控過程中，研究者們推測DPCs的蛋白質可能被蘇木化修飾，經SUMO分子標記后被Wss1水解。如經CPT處理后，拓撲異構酶獲得了大量蘇木化修飾[47-48]。另一觀點則認為復制叉受到DPCs的阻礙并停滯后，與復制相關蛋白質被蘇木化修飾，進而招募Wss1到損傷位點水解DPCs的蛋白質，移走DPCs[49]。因此，蘇木化修飾與DPCs的修復相關，可能是招募Wss1到DPCs損傷位點的關鍵因素，且Cdc48可能涉及DPCs的修復。

SPRTN是后生動物中與Wss1同源的蛋白酶，其序列與Wss1高度相似[50]。SPRTN與Wss1的功能相似，如SPRTN發揮功能時需要p97（與Cdc48的同源）的協助，能通過C端的基序結合泛素或類泛素小分子[41]。此外兩者也存在不同，Wss1能直接結合DNA[4]，而SPRTN是通過PCNA招募到DNA[41]。Wss1在胞內的蛋白濃度低，通過自我分離進行調控，而SPRTN通過泛素—蛋白酶體途徑調控表達水平[7]。

蛋白酶SPRTN也參與了DPCs的修復。在哺乳動物細胞中，通過siRNA敲除SPRTN導致細胞對FA高度敏感，以及形成持久性的DPCs[41]。研究發現SPRTN在復制過程中切除DPCs保護增殖的細胞免受DPCs的細胞毒性，然而缺失SPRTN（如RJALS疾病、SPRTN單倍體不足小鼠）引起DPCs的病理性積累，造成DNA復制叉停滯，進而導致DNA雙鏈缺口和基因組的不穩定性[51]。此外，研究發現SPRTN通過一些調節機制提高特異性，防止不涉及DPCs的蛋白質發生錯誤的水解。如控制SPRTN活性的泛素開關。SPRTN處于單泛素化狀態時不能與DNA結合;僅當檢測到DPCs時SPRTN才會發生去泛素化，從而使SPRTN能夠與受損的DNA位點結合[51]。因此，與DNA結合的SPRTN數量與DPCs的豐度成正比。

2.3?DPCs的其他修復途徑

除了上述的修復途徑以外，核酸切除修復（nucleotide excision repair，NER）和同源重組修復（homologous recombination，HR）與DPCs的修復和耐受相關，然而這2種經典的修復通路在DPCs修復過程中發揮的具體功能以及調控機制尚不明確。

研究顯示缺失NER或HR的酵母細胞對CPT和甲醛都敏感，表明NER和HR與DPCs的耐受相關[4，52]。中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞的NER通路涉及修復FA誘導的DPCs，但并沒有涉及修復乙醛誘導的DPCs[53]。此外，研究發現NER只能修復蛋白質較小的DPCs。體外試驗顯示哺乳動物的NER能夠有效去除蛋白質大小在8 kD以下的DPCs，然而在體內不能除去7.4或者8.0 kD的DPCs;研究還發現細菌的NER能夠除去交聯蛋白小于14 kD的DPCs[54-56]。蛋白質較大的DPCs需通過蛋白裂解成較小的肽，成為能被NER修復的底物。因此，NER可能是蛋白酶Wss1/SPRTN酶切DPCs的下游通路。

研究發現在細菌中，HR參與修復DPCs，且不受蛋白質大小的限制，能夠修復蛋白質在14 kD以上DPCs[57]。在哺乳動物中，HR與FA誘導的DPCs的耐受密切相關，包括小于7.4 kD的DPCs[56]。缺失HR的細胞對FA敏感，顯示HR涉及修復各種醛類誘導的DPCs[58]。5-AzadC誘導的DNMT形成DPC，造成Rad51焦點和姐妹染色單體交換增加，表明HR涉及修復該損傷[17]。此外，研究表明在大腸桿菌和雞細胞中，修復DPCs時需要存在DNA雙鏈缺口的形式[59]，而在其他細胞沒有觀察到該現象[60-61]。Rad52和Wss1在酵母中以非上位的方式參與了甲醛誘導的DPCs的修復，這表明HR和蛋白酶Wss1對DPCs的作用是比較獨立的2個途徑[4]，這與NER不同。綜上，經典的修復通路HR和NER參與了DPCs的修復，且修復途徑的選擇可能涉及多個因素的影響，如蛋白質的大小、損傷形式和程度等[41]。目前，HR和NER在DPCs修復過程中發揮的具體功能以及調控機制有待更加深入的研究。

3?小結與進展

DPCs是一種特殊類型的DNA損傷，具有一定的細胞毒性，會阻礙DNA復制，導致DNA雙鏈缺口、基因突變、染色體重排，甚至是細胞死亡[5]。根據形成方式不同，DPCs分為酶型和非酶型2種[4]。酶型DPCs是指由酶與DNA共價交聯形成。一些酶發揮調控作用時，需與DNA結合形成酶-DNA復合物，如Top1cc。但酶-DNA復合物受堿基缺失、突變等DNA損傷的影響時，導致酶-DNA復合物形成酶型DPCs[7]。另外，一些酶的抑制劑，如Top1的抑制劑CPT[4]、DNA甲基轉移酶（DNMTs）的抑制劑5-AzadC等[17]，導致酶與DNA交聯形成DPCs。非酶型DPCs是非特異性的蛋白質與DNA共價交聯形成。在一些內源性和外源性因子的作用下，會導致非酶型DPCs。內源性因子是細胞代謝過程中產生的副產物，如甲醛、乙醛等活性醛。外源性因子是紫外線、離子輻射、抗癌藥物等[5]。

相比DNA單鏈缺口、堿基缺失等其他類型的DNA損傷，DPCs的具體修復途徑并不清楚。研究發現Top1形成的酶型DPCs的修復是通過蛋白酶體和Tdp?蛋白酶體將蛋白質降解，然后殘余在DNA上的小肽被Tdp1移走[39]。此外，NER和HR都涉及了DPCs的修復，但具體的作用機制并不清楚。NER作用于蛋白質較小的DPCs，而HR則不受限制[4，52]。最近，研究發現DPCs的修復是通過蛋白質水解途徑進行[7]。酵母的蛋白酶Wss?以及后生動物的蛋白酶SPRTN能夠水解DPCs的蛋白質為小肽，DPCs轉變為較小的復合物，便于DNA能夠跨過損傷進行復制[40]。此外，研究發現NER和蛋白酶體或蛋白酶存在協同作用。針對蛋白質較大的DPCs，蛋白酶體和蛋白酶能夠先降解或水解蛋白質，使DPCs的大小降低到NER能夠修復的范圍內，再由NER修復DPCs[40]。而HR和蛋白酶Wss1對DPCs的作用則是相對獨立的2個途徑[4]。

介紹了DPCs的研究進展，主要總結分析了DPCs的形成以及修復途徑，強調了其修復機制的重要性。研究結果提示鑒定參與DPCs修復過程的蛋白質將有助于揭示其具體的修復機制。

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