梯度洗脫HPLC法測定雞蛋中替米考星的殘留

張莉 鄭舉 吳昊 劉紅云 吳蕾 明文慶 蔡一杰

摘要?[目的]建立雞蛋中替米考星的高效液相色譜殘留分析方法。[方法]樣品在乙腈提取下經Oasis PRIME HLB固相萃取小柱凈化，氮吹濃縮后定容過膜上機檢測。采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以水-磷酸二丁胺緩沖液（97∶25）為流動相A、乙腈為流動相B進行梯度洗脫。檢測波長280 nm。[結果]替米考星在0.05～10.00 μg/mL具有良好的線性關系（R2=0.999 8）。替米考星在雞蛋中的添加水平為0.1、1.0、5.0 μg/mL時，回收率為80.6%～95.7%，批內、批間的相對偏差小于10%。[結論]該試驗建立的HPLC法簡便、靈敏、準確，適用于雞蛋中替米考星的測定。

關鍵詞?雞蛋;替米考星;梯度洗脫HPLC法;殘留

中圖分類號?S851.34+7文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）20-0217-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.059

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determination of Tilmicosin Residues in Egg by Gradient Elution HPLC Method

ZHANG Li1，2，ZHENG Ju3，WU Hao1，2 et al?（1.Anhui Province Institute of Veterinary Drug and Feedstuff，Hefei，Anhui 230091;2.Anhui Province Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety Engineering，Hefei，Anhui 230061;3. Anhui Province Animal Disease Prevention and Control Center，Hefei，Anhui 230091）

Abstract?[Objective] The research aimed to establish a method for determination of tilmicosin in eggs by high performance liquid chromatography.[Method]The samples were purified by Oasis PRIME HLB solid phase extraction column under the extraction of acetonitrile.After drying and concentrating，the samples were reused and tested over the membrane.Analysis was performed on a C18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm） by gradient elution using water?butyl amine phosphate（975∶25）（A）?acetonitrile（B）as mobile phase.The determination wave length was 280 nm.[Result]The tilmicosin had a good linear relationship （R2 = 0.9998） at 0.05-10.00 μg/mL. When the addition level of tilmicosin in eggs was 0.1， 1.0， 5.0 μg/mL， the recovery was 80.6% - 95.7%， and the relative deviation within and between batches was less than 10%.[Conclusion]The HPLC method established in this experiment is simple， sensitive and accurate， and is suitable for the determination of tilmicosin in eggs.

Key words?Egg;Tilmicosin;Gradient elution HPLC;Residue

雞蛋是生活中最常見的高營養食材，它含有大量蛋白質和多種微量元素，是人類“理想的營養庫”，能滋補身體，也能補中益氣，緩解體虛，多數人每天都會吃雞蛋。我國是一個雞蛋產量位于世界首位的國家，絕大部分的雞蛋產自農戶和小規模的養殖場，在蛋雞的飼養過程中，尤其在產蛋期，由于不合理使用藥物以及未嚴格遵守休藥期，導致雞蛋中的藥物殘留，危害人體健康[1-4]。目前，我國對雞蛋中藥物殘留的研究較少，各種標準尚在完善中。筆者針對一種大環內酯類藥物——替米考星在雞蛋中的殘留進行方法研究。替米考星是泰樂菌素經水解后的衍生物，是畜禽專用的大環內酯類抗生素，體外抗菌活性強，對支原體、胸膜肺炎放線菌和巴氏桿菌等均有抑制作用，臨床上主要用于防治家畜肺炎、禽支原體病及泌乳動物的乳腺炎[5-9]。我國2002年農業部公告第235號及2005年農業部公告第560號規定了替米考星在動物組織中的最大殘留限量（MRL）為100 μg/kg，同時在產蛋期時禁止使用替米考星[10-11]。該試驗采用梯度洗脫高效液相色譜法，建立雞蛋中大環內酯類抗生素替米考星的簡便、快速、高效的檢測方法。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗材料。取新鮮的雞蛋去殼，充分攪拌，勻質，置2～8 ℃冰箱保存。

1.1.2?藥品與試劑 。替米考星對照品（批號K0311407，含量98.9%，中國獸醫藥品監察所）;乙腈為色譜純（Merck KGaA 公司）;二丁胺、磷酸、氫氧化鈉均為分析純，國藥集團;試驗用水為 milli-Q 超純水。

1.1.3?儀器與設備。Agilent 1100型高效液相色譜儀（G1311A四元泵），G1379A真空在線脫氣機，G1315DAD檢測器，G1316A柱溫箱），美國Agilent公司;BT-125D 電子天平，賽多利斯;IKA渦旋混合機，上海滬西分析儀器廠有限公司;Sigma3-30KS離心機;KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;HGC-12A氮吹儀，天津市恒奧科技發展有限公司;Oasis PRIME HLB固相萃取小柱（60 mg/3 mL，200 mg/6 mL填料），Waters公司;0.25 μm微孔濾膜，天津津騰試驗設備有限公司;10份雞蛋樣品購自市場（合肥市不同超市的品牌）。

1.2?方法

1.2.1?標準儲備液的配制。取替米考星對照品適量，精密稱定，加乙腈制成每1 mL中含1 mg的溶液，精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，用磷酸溶液（取水900 mL，加磷酸5.71 g，用12.5 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至2.5±0.?加水至1 000 mL）稀釋至刻度，搖勻，制成0.2 mg/mL的標準儲備液。在試驗中用磷酸溶液配制成不同濃度的標準工作液，現配現用。

1.2.2?樣品前處理。

1.2.2.1?樣品的提取。準確稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加乙腈10 mL，渦旋混勻，超聲10 min，高速冷凍離心8 000 r/min離心10 min。

1.2.2.2?樣品的凈化。移取5 mL上清液，直接過6cc規格Oasis PRIME HLB固相萃取柱，保持1 s/滴速度，收集濾液。準確量取2 mL濾液至10 mL具塞玻璃管中，在40 ℃水浴氮氣吹干。殘留樣品用磷酸溶液溶解定容至1.00 mL，過0.25 μm濾膜后，轉移至2 mL進樣小瓶中，待HPLC測定。

1.2.2.3?色譜測定條件。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：水-磷酸二丁胺緩沖液[取二丁胺16.8 mL，加磷酸溶液（1→10）70 mL，邊加邊攪拌，放冷后，用磷酸調節pH至2.5±0.?加水至100 mL]（975∶25）為流動相A，乙腈為流動相B，按表1梯度洗脫程序;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;記錄280 nm的色譜圖;進樣量10 μL。

2?結果與分析

2.1?對照品、空白試驗、樣品的色譜圖?替米考星色譜圖中包含反式異構體和順式異構體，相對保留時間為0.9、1.0，色譜圖見圖1～3。該色譜條件下替米考星的分離度、理論塔板數均符合2015年版中國獸藥典的要求，此條件適合測定雞蛋中的替米考星。

2.2?方法學考察

2.2.1?標準曲線的繪制。精密量取對照品儲備液適量，用磷酸溶液稀釋成0.05、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL的系列對照品溶液，按“1.2.2.3”色譜條件，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積，以各對照品質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸計算，得出線性方程為Y=0.369 2X+0.008 4（R2=0.999 8），線性范圍為0.05～10.00 μg/mL。結果表明在線性范圍內替米考星濃度與峰面積呈現良好的線性關系。

2.2.2?檢出限和定量限的測定。吸取適量替米考星標準工作液，用空白雞蛋樣品溶液稀釋成0.010、0.025、0.050和1.000 μg/mL，按“1.2.2”樣品處理方法處理后，以溶液檢測時的信噪比（S/N）分別大于等于3和10作為該藥物的檢出限和定量限。該方法的檢出限、定量限分別為0.025 μg/kg（S/N≥3）、0.050 μg/kg（S/N≥10），符合試驗及相關要求。

2.2.3?回收率及精密度測定。采用標準添加法，稱取空白雞蛋樣品至50 mL離心管中，添加替米考星標準工作液，制成0.1、1.0、5.0 μg/mL 3個濃度的替米考星空白雞蛋添加溶液，每種濃度5個樣品，重復3批，按“1.2.2”樣品處理方法處理后，供HPLC測定，外標法定量，計算回收率、批內、批間變異系數，結果見表2。數據顯示該方法回收率和精密度均較好，方法可行。

2.2.4?樣品測定。從市場隨機購買樣品10份，均未檢出替米考星藥物。

3?結論與討論

3.1?樣品提取及凈化方法的優化?替米考星不溶于水，易溶于甲醇、乙腈、丙酮等溶劑。雞蛋中含有較多的蛋白質，蛋白質會形成泡沫、渾濁或出現沉淀現象時被分析物難以分離。乙腈是一種中等極性的提取溶劑，與大多數獸藥的極性較接近，該研究在方法的提取研究過程中，采用酸性乙腈、堿性乙腈、純乙腈、20%乙腈、50%乙腈、80%乙腈進行提取試驗，結果顯示，純乙腈的提取效率最好，對不同濃度的添加試驗其回收率均高于80%，符合藥物殘留檢測的要求。在對離心機的轉速和時間的選擇上，通過試驗最終確定8 000 r/min離心10 min的除雜效果最好。

該試驗用固相萃取技術進行樣品凈化。Oasis PRIME HLB固相萃取小柱有別于傳統的固相萃取小柱，它不需要活化、平衡、凈化時也不需要不同極性或pH的溶劑進行淋洗、洗脫等，該小柱能極大地提高樣品分析通道。該試驗通過加標回收試驗比較了200 mg/6 mL和60 mg/mL 2種規格的固相萃取小柱測定替米考星的回收率，試驗結果顯示，當用乙腈作為提取溶劑，Oasis PRIME HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL填料）凈化時，替米考星的回收率達到80%以上。試驗最終選擇Oasis PRIME HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL填料）對樣品進行凈化處理。

3.2?色譜條件的優化?替米考星具有弱堿性和脂溶性，在呈酸性的流動相色譜條件下的反相色譜柱上能較好地保留，試驗選擇了4款不同品牌的反相色譜柱Phenomenex Luna C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）、Waters XSelect CSH C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Aglient Eclipse XDB C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱和依特利SinoChromODS-AP8（4.6 mm×250 mm，5 μm）進行樣品分析，結果表明4種品牌色譜柱均可使替米考星分離度、理論塔板數、對稱因子良好。因所分析樣品基質復雜，雖然經過提取、離心、凈化處理，但是樣品在流動相等度洗脫的條件下分析，其分離度和靈敏度均難以滿足試驗要求，為達到分離度、靈敏度的要求，該試驗通過比較流動相A[水-磷酸二丁胺緩沖液（975∶25）]、流動相B（乙腈）不同的梯度洗脫方式，最終確定梯度洗脫：0～30 min，82%～60% A;30～32 min，60%～82% A;32～40 min，82%～18% A，在分析雞蛋中的替米考星時，其分離度、靈敏度滿足雞蛋中的替米考星殘留分析要求。

4?小結

該試驗建立的梯度洗脫HPLC法測定雞蛋中替米考星殘留的方法，靈敏度高，專屬性強。替米考星的檢出限達0.025 μg/kg，采用Oasis PRIME HLB小柱（200 mg/6 mL填料）凈化，省去了活化、平衡、淋洗、洗脫等繁瑣的操作步驟，處理后雜質干擾少，滿足雞蛋中替米考星殘留檢測要求。

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