缺血預(yù)適應(yīng)聯(lián)合硒/丹參酮ⅡA對(duì)大鼠子宮再灌注損傷的影響

張爽 王冬

【摘要】 目的 研究缺血預(yù)適應(yīng)聯(lián)合硒/丹參酮ⅡA對(duì)大鼠子宮再灌注損傷的影響。方法 清潔級(jí)Wistar大鼠64只， 隨機(jī)分為A組（模型組）、B組（預(yù)適應(yīng)組）、C組（預(yù)適應(yīng)+硒組）、D組（預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組）， 每組16只。四組大鼠均采用線栓法制備缺血再灌注損傷模型， 預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組在造模前2 h、1 h和30 min各進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的缺血15 s+再灌注30 s。預(yù)適應(yīng)+硒組在術(shù)前7 d起給予飲水中加入硒酵母片2～4 μg/（kg·d）， 預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組于術(shù)前7、5、3、1 d給予腹腔注射丹參酮ⅡA注射液20 mg/kg。缺血再灌注2 h取大鼠子宮組織， 利用分光光度計(jì)測(cè)量大鼠子宮組織勻漿中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）值， 免疫組化染色法（SABC）檢測(cè)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）蛋白表達(dá)， 并進(jìn)一步行Western blot。結(jié)果 預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中MDA、 SOD水平均低于模型組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;預(yù)適應(yīng)組與預(yù)適應(yīng)+硒組大鼠子宮組織中MDA、 SOD水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組大鼠子宮組織中MDA水平均高于預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組， SOD水平均低于預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平分別為（25.7±3.9）、（26.4±3.7）、（29.9±4.2）， 均高于模型組的（17.2±2.5）， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;預(yù)適應(yīng)組與預(yù)適應(yīng)+硒組的大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 缺血預(yù)適應(yīng)、缺血預(yù)適應(yīng)聯(lián)合硒/丹參酮ⅡA對(duì)大鼠子宮缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用， 且缺血預(yù)適+丹參酮ⅡA對(duì)其保護(hù)作用明顯提高。

【關(guān)鍵詞】 缺血預(yù)適應(yīng);缺血再灌注損傷;丹參酮ⅡA;硒;子宮組織;大鼠

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.28.112

【Abstract】 Objective? ?To study the effect of ischemic preconditioning combined with selenium/tanshinone ⅡA on uterine reperfusion injury in rats. Methods? ?A total of 64 clean Wistar rats were randomly divided into group A （model group）， group B （preconditioning group）， group C （preconditioning + selenium group）， and group D （preconditioning + tanshinone ⅡA group）， with 16 rats in each group. The models of ischemia-reperfusion injury were prepared by suture method in four groups of rats. The preconditioning group， preconditioning + selenium group， preconditioning + tanshinone ⅡA group were performed for 3 cycles of ischemia 15 s+ reperfusion 30 s at 2 h，?1 h and 30 min before modeling. Preconditioning + selenium group was given 2～4 μg/（kg·d） of selenium yeast tablets in drinking water at 7 d before operation， and the preconditioning + tanshinone ⅡA group was given intraperitoneal injection of tanshinone ⅡA injection 20 mg/kg at 7， 5， 3 and 1 d before operation. Uterine tissue was taken from rats after 2 h of ischemia-reperfusion. The values of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） in rat uterine homogenate were measured by spectrophotometer， and the expression of Bcl-2 gene was detected by immunohistochemical staining （SABC） and further by Western blot. Results? ?The levels of MDA and SOD of uterine tissue in preconditioning group， preconditioning + selenium group， preconditioning + tanshinone ⅡA group were lower that those in model group， and their difference was statistically significant （P<0.05）. There was no statistically significant difference in levels of MDA and SOD of uterine tissue in preconditioning group and preconditioning + selenium group （P>0.05）. The MDA level of uterine tissue in preconditioning group and preconditioning + selenium group was higher than that in preconditioning + tanshinone ⅡA group， and SOD level was lower than that in preconditioning + tanshinone ⅡA group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. The expression level of Bcl-2 of uterine tissue in preconditioning group， preconditioning + selenium group， preconditioning + tanshinone ⅡA group were （25.7±3.9）， （26.4±3.7） and （29.9±4.2） respectively， and those were all higher than （17.2±2.5） in model group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. There was no statistically significant difference in expression level of Bcl-2 of uterine tissue between preconditioning group and preconditioning + selenium group （P>0.05）. The expression level of Bcl-2 of uterine tissue in preconditioning + selenium group was higher than those in preconditioning group and preconditioning + selenium group， and their difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? ?Ischemic preconditioning and ischemic preconditioning combined with selenium/tanshinone ⅡA have protective effects on uterine ischemia-reperfusion injury in rats， and the protective effect of ischemic preconditioning + tanshinone ⅡA is obviously improved.

【Key words】 Ischemic preconditioning; Ischemia-reperfusion injury; Tanshinone ⅡA; Selenium; Uterine tissue; Rats

缺血再灌注損傷主要是指恢復(fù)缺血組織的血流灌注對(duì)組織造成的嚴(yán)重?fù)p傷， 而缺血預(yù)適應(yīng)主要是指短暫缺血再灌可增強(qiáng)組織對(duì)隨后較長(zhǎng)時(shí)間缺血損傷耐受性的現(xiàn)象。國內(nèi)外關(guān)于缺血再灌注損傷及缺血預(yù)適應(yīng)的研究主要集中于心、腦、腎等重要組織器官[1， 2]。子宮是人體重要的生殖器官， 缺血再灌注損傷影響生殖功能。本課題組前期工作已完成子宮缺血再灌注損傷模型[3]， 并證實(shí)了中藥丹參酮ⅡA[4]對(duì)子宮缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。本研究通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺血預(yù)適、缺血預(yù)適應(yīng)聯(lián)合硒/丹參酮ⅡA對(duì)大鼠子宮缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用， 且缺血預(yù)適+丹參酮ⅡA對(duì)其保護(hù)作用明顯提高， 對(duì)臨床工作提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料 選用清潔級(jí)8周齡Wistar雌性大鼠64只， 體重178～246 g， 由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供， 許可證號(hào)：SCXK（吉）2008-0005。隨機(jī)分為模型組、預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組， 每組16只。

1. 2 儀器和試劑 TD5A型凱達(dá)離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）， 電子精密天平（上海精密儀器儀表有限公司）， UV-755B型紫外可見分光光度計(jì)（上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司）， 顯微鏡（上海醫(yī)療器械七廠）。BCl-2原位雜交檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）， MDA測(cè)定試劑盒（北京雷根生物科技有限公司）， SOD活性檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。硒酵母片（牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司）， 丹參酮ⅡA（上海第一生化藥業(yè)有限公司）。

1. 3 模型的制備 采用線栓法制備缺血再灌注損傷模型。各組大鼠造模前6 h禁食， 室溫20～ 25℃， 用體積分?jǐn)?shù)10%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠， 視大鼠角膜反射、是否有肌肉顫動(dòng)等情況， 將大鼠維持一定的麻醉深度， 成功后， 將其仰臥固定， 于下腹部正中做一縱形切口， 長(zhǎng)（5±1） cm， 并以切口下端為中點(diǎn)， 向兩側(cè)各延長(zhǎng)1 cm， 形成一“⊥”形切口， 以便充分暴露大鼠子宮及鄰近臟器， 將兩側(cè)腹壁組織外翻， 4-0絲線縫扎固定， 以避免遮擋視野， 增加手術(shù)時(shí)間， 用濕潤棉簽和眼科鑷輕柔向上推離大鼠腸管， 暴露大鼠子宮， 大隱靜脈注射50 U/kg肝素5 min后， 應(yīng)用玻璃分針鈍性分離大鼠腹腔動(dòng)脈， 注意辨明髂腰動(dòng)、靜脈， 避免損傷致大出血， 在髂總動(dòng)脈分叉處上方0.5 cm處用4-0絲線以方結(jié)結(jié)扎腹腔動(dòng)脈， 剪斷下腹壁兩側(cè)固定縫扎線， 以減少大鼠腹腔臟器水分的流失， 30 min后去除結(jié)扎線， 形成再灌注[3]。

1. 4 實(shí)驗(yàn)方法 除模型組外， 預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組在造模前2 h、1 h、30 min各行3個(gè)循環(huán)的缺血15 s+ 再灌注30 s）。預(yù)適應(yīng)+硒組在術(shù)前7 d起給予飲水中加入硒酵母片2～4 μg/（kg·d）， 預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組于術(shù)前7、5、3、1 d給予腹腔注射丹參酮ⅡA注射液20 mg/kg。采用線栓法建立大鼠子宮缺血再灌注損傷模型。再灌注2 h取大鼠子宮組織， 將子宮組織在冰冷生理鹽水中漂洗干凈， 除去血液， 濾紙拭干， 稱質(zhì)量后加入4℃的HEPES緩沖液中， 其體積是子宮組織塊質(zhì)量的9倍， 用玻璃勻漿器制成勻漿， 勻漿液以3000 r/min離心15 min， 取上清液， 70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩０丛噭┖姓f明書， 利用分光光度計(jì)檢測(cè)大鼠子宮組織的SOD、MDA水平。取大鼠子宮組織， 入4%多聚甲醛固定24 h， 常規(guī)石蠟包埋、脫水、切片， 厚5 μm， 小鼠抗大鼠Bcl-2單克隆抗體活性檢測(cè)試劑， 參照免疫組化試劑盒說明書， 嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟行免疫組織化學(xué)染色， 以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照， DAB顯色， 鏡下觀察顯色， 蘇木精輕度復(fù)染， 梯度脫水， 透明中性樹膠封片。陽性判斷：Bcl-2陽性為胞質(zhì)及胞膜內(nèi)側(cè)出現(xiàn)黃至棕黃色顆粒， 每只大鼠取4張切片染色， 每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野（×400）， 計(jì)數(shù)每個(gè)高倍鏡視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)， 求其平均值， 并取大鼠子宮組織的勻漿樣本進(jìn)行 Western blot。目的蛋白的I抗稀釋度為1︰400， 抗GAPDH的I抗稀釋度為1︰6000， 4 ℃過夜。Ⅱ抗[山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）， 稀釋度為1：2000]室溫振蕩孵育2 h， 洗滌后顯影。采用 Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)各條帶的總灰度值作相對(duì)定量比較。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 各組大鼠子宮組織中MDA、SOD水平比較 預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中MDA、 SOD水平均低于模型組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;預(yù)適應(yīng)組與預(yù)適應(yīng)+硒組大鼠子宮組織中MDA、 SOD水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組大鼠子宮組織中MDA水平均高于預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組， SOD水平均低于預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 各組大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平分別為（25.7±3.9）、（26.4±3.7）、（29.9±4.2）， 均高于模型組的（17.2±2.5）， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;預(yù)適應(yīng)組與預(yù)適應(yīng)+硒組的大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。其Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖1。