大口黑鱸池塘工程化循環水養殖系統的溶解氧時空變化及菌群響應特征

王 朋 徐鋼春 徐 跑,

(1. 南京農業大學無錫漁業學院, 無錫 214081; 2. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心, 農業農村部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室, 無錫 214081)

池塘工程化循環水養殖系統(In-pond Raceway System, IPRS)由奧本大學和美國大豆協會設計并推廣。該系統以“大面積凈水, 小面積養魚”為特色,資源節約、環境友好, 兼顧經濟效益與社會效益,具有傳統池塘養殖所沒有的諸多優勢。在IPRS中進行高密度精養, 所有水槽通過流水共用同一水體。因此, IPRS中水體菌落變化也將與傳統養殖池塘不同。

大口黑鱸(Micropterus salmoides)原產于美國,在20世紀80年代引入中國, 由于其肉質鮮美營養豐富而受到消費者青睞, 市場廣闊, 但是近年來魚病頻發讓養殖戶損失慘重[1]。其中, 多種細菌引起的繼發感染是造成重大損失的主要原因[2]。此外, 研究表明水體和底泥中的菌群還會影響腸道菌落結構[3]。因此, 研究水體菌群變化對水產養殖中的疾病預防和生態調控具有重要意義。

高通量測序技術作為成熟有效的技術手段, 已經成為鑒別分析細菌群落的主要方式[4]。其優勢主要在于可以不經過分離純化就可以全面、精準地分析細菌的種類和相對豐度[5]。在過去的研究中,高通量測序技術被廣泛應用于土壤、底泥、水體和腸道菌群的研究[6]。本實驗對IPRS中溶解氧(Dissolved oxygen content, DOC)和菌群的時空變化研究, 以期為水產品健康養殖和水體生態調控提供更多科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

IPRS 位于中國水產科學研究院淡水漁業研究中心揚中實驗基地(圖 1), 水體面積為58 m×666 m。水槽規格為25 m×5 m×2.5 m(分別對應長、寬、高), 共12套。2017年6月中旬, 低、高密度水槽各放入15000尾和25000尾大口黑鱸(均重10 g), 由工人負責投喂和日常管理。7—11月份, 每月月初采樣, 沿水槽對角線的兩頂點, 從不同深度(0.5、1和1.5 m)處取等量水體并在水桶中混合均勻, 盛取500 mL作為樣本。糞便收集區取樣方案類似。在晝夜變化中, 在DOC最高和最低時分別取樣并用便攜式溶氧儀[哈希水質分析儀(上海)有限公司]測量溶解氧。對采集到的水體樣本進行編號, 以便后續處理。編號第一位數字代表月份, 第二位數字代表密度, “4”代表低密度組, “5”代表高密度組。編號第三位代表DOC, “1”代表DOC最高, “2”代表DOC最低。第四位數字代表不同區域, “1”代表養殖區,“2”代表糞便收集區。如: 樣本編號“7-411”, 代表7月份低密度組DOC最高時養殖區樣本, 依此類推。待1次采樣完成后, 在4℃的條件下以12000 r/min的轉速離心8min, 保留沉淀。上清液用孔徑0.22 μm 的濾膜抽濾, 將濾膜和沉淀在2 mL的離心管內混合, 作為送檢樣本并暫存于-80℃的冰箱中。

1.2 樣本DNA提取、PCR擴增及高通量測序

待所有樣本處理完畢, 送至美吉生物科技有限公司(上海), 對16S rDNA 基因V3-V4區進行PCR擴增, 引物序列為338F(5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′)。進行基于Illumina Miseq測序平臺的高通量測序。測序數據經過過濾、拼接后將有效序列返回。

1.3 數據分析

利用美吉I-Sanger云平臺(Usearch Vsesion 7.0)對樣本有效序列進行聚類分析, 默認將具有97%一致性的有效序列聚類為同一操作分類單元(Operational taxonomic unit, OTU)。通過將構建OTU時選取的代表序列與Silva (Release128)和Greengene (Release 13.5)數據庫進行比對, 對OTU進行注釋, 在結果分析中將OTU視為一種細菌。為了消除樣本因序列數不同引起的差異, 以序列數最少的樣本為依據, 對所有樣本進行均一化處理(Cutoff=241908), 并以處理后的數據為基礎進行后續的多樣性分析。采用SPSS 20.0軟件對數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 當P＜0.05時, 說明不同分組之間差異顯著。采用Person相關分析方法分析優勢菌群與DOC和水溫之間的相關性,r表示相關系數, *表示相關性顯著(P＜0.0.5),**表示相關性極顯著(P＜0.01)。

2 結果

2.1 測序結果

40個樣本共得到1441319個有效序列, 并聚類于41門、629屬、1928個OTU (表 1)。其中, 657個OTU為7—11月份所共有。測序深度均在98.8%以上, 證明所有樣本中菌群多樣性均被有效覆蓋。

2.2 7—11月份細菌群落豐度變化

當DOC最高時, sobs指數在低、高密度組中養殖區和糞便收集區的變化趨勢類似(最大值出現在9月, 最小值在10月)。糞便收集區的菌群豐富度整體高于水槽養殖區, 且在9月和11月, 低密度組的菌群豐富度明顯高于高密度組。當DOC最低時, 菌群豐富度在養殖區的變化趨勢與DOC最高時一致, 但在糞便收集區的菌群豐富度受到巨大影響, 菌群豐度最高值出現在8月(低密度組)和11月(高密度組),且其最高豐度明顯低于養殖區。在9月之外的其他月, 糞便收集區的菌群豐富度普遍高于養殖區, 且數量差異明顯(圖 2)。

圖1 IPRS系統及流水槽結構示意圖Fig. 1 Sketch of IPRS and aquaculture channel

在DOC最高時, 養殖區和糞便收集區及DOC最低時養殖區的菌群豐富度具有相同的變化趨勢(最高值在9月, 最低值在10月)。在糞便收集區、DOC最低時, 低密度組的菌群多樣性在9月最高, 而高密度組則是11月, 這與菌群多樣性季節變化的整體趨勢明顯不同。綜合來看, 菌群豐富度最高值出現在9月、糞便收集區、DOC最高時; 最低值出現在10月、養殖區、DOC最高時。在7—11月份的季節變化中, 高密度組的菌群豐度變化幅度小于低密度組, 且高、低密度組皆在糞便收集區、DOC最低時變化幅度最小(圖 3)。

表1 高通量測序結果分析

Tab. 1 The results of the high-through sequencing analysis

樣本Sample 有效序列Effective reads測序深度Goods coverage七月July 323358 1208 0.991八月August 308630 1367 0.990九月September 305065 1654 0.988十月October 262358 1156 0.991十一月November 241908 1192 0.992有效OTUEffective OTU

從整體上看, 除低密度組在9月、糞便收集區外, 同一區域中DOC最低時的菌群豐富度普遍高于DOC最高時, 且菌群豐富度在低密度組中的變化幅度明顯高于高密度組。這表明在晝夜變化中, 菌群豐富度可能與DOC存在負相關關系。在低密度組的糞便收集區, 菌群多樣性在9月份的晝夜差異巨大, 除DOC較低外, 還可能受水溫影響(圖 4)。

以上結果表明, 糞便收集區的菌群豐富度普遍高于養殖區, 且當DOC最低時差異更加明顯。除9月糞便收集區外, 菌群多樣性在低密度組中的變化幅度明顯高于高密度組。

2.3 基于門水平的菌群變化

在7—11月份的季節變化中, 相對豐度前四的細菌分別是: 變形菌(Proteobacteria)、放線菌(Actinobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)和藍細菌(Cyanobacteria), 且它們在不同月份中的變化情況各不相同(圖 5)。

圖2 Sobs指數在低、高密度組不同區域中的變化Fig. 2 Sobs index variation in different areas of low and high stocking density channel

在DOC最高時, 變形菌在7、9、11月養殖區的相對豐度總是高于糞便收集區。當DOC最低時, 除10月外, 變形菌在養殖區的相對豐度總是低于糞便收集區。9月, 低密度組養殖區的放線菌相對豐度總是高于糞便收集區, 但是高密度組中情況則相反;當DOC最高時, 放線菌在養殖區的相對豐度總是高于糞便收集區; 當DOC最低時, 放線菌在養殖區的相對豐度總是低于糞便收集區。10和11月, 放線菌在低密度組養殖區的相對豐度總是低于糞便收集區, 在高密度組養殖區的相對豐度總是高于糞便收集區。7月, 放線菌在低密度組養殖區的相對豐度總是低于糞便收集區, 而在8月的高密度組中情況則相反。8月, 擬桿菌在養殖區的相對豐度總是高于糞便收集區, 在其他月份中養殖區的相對豐度總是低于糞便收集區。10月, 藍細菌在養殖區的相對豐度總是低于糞便收集區。在11月低密度組中, 藍細菌在養殖區的相對豐度總是低于糞便收集區, 而在高密度組中養殖區的相對豐度總是高于糞便收集區。其他月中, 除7月低密度組和8月高密度組外,藍細菌在養殖區的相對豐度總是高于糞便收集區。

圖3 Sobs指數在低、高密度組中的變化Fig. 3 Sobs index variation in low and high stocking density channel

圖4 Sobs指數在低高密度組中隨DOC的變化Fig. 4 Sobs index variation with DOC in low and high stocking density channel

2.4 基于屬水平的菌群變化

從整體上來看, 細菌豐度前十的物種為: 假單胞菌(Pseudomonas)、黃桿菌(Flavobacterium)、聚球菌(Synechococcus)、藍細菌(Cyanobacteria)、CL500-29_marine_group、hgcl_clade、Alpinimonas、分枝桿菌(Mycobacterium)、MNG7和Limnohabitans(圖 6)。從區域角度分析, 除8月外, 假單胞菌在養殖區的相對豐度總是高于糞便收集區。除7月外,CL500-29_marine_group具有與之相同的變化趨勢。聚球菌在養殖區的相對豐度總是高于糞便收集區,hgcl_clade和Alpinimonas在養殖區的相對豐度總是低于糞便收集區, 但差距不大。

7、8月, 假單胞菌在低、高密度組中的相對豐度差異巨大, 分別為(5.58%、0) 和 (0.76%、5.68%)。CL500-29_marine_group在低密度組中的相對豐度總是低于高密度組,Alpinimonas在除10月外的其他月中變化情況與此相同, 而hgcl_clade在低密度組中的相對豐度總是高于高密度組。7月和10月, 藍細菌在低密度組中的相對豐度總是低于高密度組,其余月份則高于高密度組。

從DOC水平分析, 除8月外, 假單胞菌在DOC最高時的相對豐度遠高于DOC最低時。除10月外, 黃桿菌也具有類似變化。除8月外,hgcl_clade在DOC最高時的相對豐度低于DOC最低時; 除7月外,Alpinimonas變化情況與之類似。7月和8月, 聚球菌在DOC最高時的相對豐度高于DOC最低時, 其他月份則相反。除9月外, 藍細菌在DOC最高時的相對豐度遠高于DOC最低時。

從季節性變化分析, 相對于其他月(低于2.46%), 聚球菌在7月(10.67%)和8月(15.22%)具有明顯優勢。黃桿菌的相對豐度在10月占據主導地位(21.64%), 但在8、9月的相對豐度則低于0.5%。假單胞菌在9—11月呈遞增趨勢;CL500-29_marine_group在7、8月占據優勢, 但在9月相對豐度僅為2.14%, 且9—11月呈遞減趨勢。藍細菌相對豐度在7—9月遞增并在10月占比最低(1.67%)。hgcl_clade在8—10月、分枝桿菌在7—11月皆呈遞減趨勢。MNG7的相對豐度在季節變化中呈現“W”型。Alpinimonas在9—11月的占比遠高于7、8月, 并在10月達到最高值。

圖5 基于門水平的細菌群落柱狀圖分析Fig. 5 Community barplot analysis on phylum level

除了相對豐度前10的物種外,Polynucleobac-ter、Sediminibacterium、Paenibacilus、Pseudarcicella和12 up相對豐度在9、10月(DOC最低時)最高, 而分枝桿菌則是在7、11月(DOC最高時)豐度最高。

2.5 差異顯著性分析

在95%的置信區間內進行單因素方差分析, 結果表明: 幾乎每種細菌相對豐度均在不同月份間差異極顯著(P＜0.01), 這表明菌群多樣性具有顯著的季節變化。DOC具有顯著的區域差異和季節差異。當1天內DOC最低和最高時,hgcl_clade具有極顯著的晝夜差異, 叢毛單胞菌、微小桿菌、羅多魯納念珠菌、Limnohabitans具有顯著晝夜差異。

2.6 基于屬水平的細菌群落相關性分析

相關性分析結果表明(表 2), 假單胞菌和DOC(r=0.415,P＜0.01)、水溫 (r=-0.427,P＜0.01)皆具有極顯著相關性, 但相關方向不同。聚球菌(r=0.636,P＜0.01)、藍細菌(r=-0.448,P＜0.01)、Alpinimonas(r=-0.428,P＜0.01)和CL500-29_marine_group (r=0.755,P＜0.01) 皆與水溫具有極顯著相關性。分枝桿菌(r=0.488,P＜0.01)、MNG7(r=0.374,P＜0.01)與DOC具有極顯著相關性。代表菌群豐富度的ace指數與DOC具有顯著相關性(r=-0.330,P＜0.05)。此外,上述細菌種群相互間具有顯著或極顯著的相關性。

圖6 基于屬水平的細菌群落柱狀圖Fig. 6 Community bar plot analysis on genus level

3 討論

微生物活性及多樣性是池塘生態系統功能組成和不可分割的一部分[7,8], 也是全球生化循環過程的重要推動力[9]。在養殖生產中, 可能是由于溶解有機碳釋放的晝夜節律, 部分菌群會在1天中的特定時間變得格外活躍[10]。DOC和菌群具有相互作用, 當DOC足夠低時, 底泥微生物通過礦化和硝化作用向水體釋放氨氮并造成水體二次污染[11]。同時, DOC也在不同程度上影響菌群的分解效率,當DOC維持在4 mg/L時菌群分解效率最高[12]。通過對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)養殖高位池中細菌16S rRNA基因V4—V5區的高通量測序和生物信息學分析, 結果表明養殖前期高密度池浮霉菌豐度顯著高于低密度池, 其他菌群差異不顯著, 在養殖后期(50—80d)放養密度對菌群多樣性的影響逐漸降低[13]。在本實驗中, 在池塘工程化循環水養殖條件下, 所有養殖水槽共用同一水體, 或許受循環水流的影響, 不同放養密度的水槽中菌群差異不顯著。

已有研究表明, DOC對細菌群落結構影響顯著?；贗llumina-MiSeq測序結果表明, 在高DOC條件下菌群豐富度會降低[14], 這與本實驗中ace指數與DOC具有顯著負相關性(r=-0.330,P＜0.05)的結果相一致。另有研究認為, 較低水平的DOC可以增加菌群豐富度, 較高水平的DOC可以增加硝化細菌的豐富度[15]。當DOC維持在2 mg/L時, 菌群豐富度更高[12], 這或許可以對本實驗中9月微生物多樣性最高的結果作出解釋(DOC均值2.56 mg/L)。對DOC差異顯著性分析, 結果表明DOC具有顯著的區域差異, 且養殖區高于糞便收集區。在9月之外的其他月份, 受DOC影響, 糞便收集區的菌群豐富度普遍高于養殖區, 且差異明顯。

表2 基于屬水平的菌群與DOC、水溫的相關性分析Tab. 2 Correlations analysis about microbial communities with DOC, water temperature on genus level

在對左海湖的研究中, 劉蘭英等[16]認為菌群結構的季節變化與水溫和營養狀況密切相關, 且不同季節中影響因素不同, 秋季主要受總氮、總磷、葉綠素的影響, 冬季主要受水溫、pH、透明度的影響。此外, 亞硝酸氮[17]、化學需氧量[18]、NH3-N[19]降解速率等因素都可能對菌群產生影響。通過對皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)養殖塘水體菌群年變化的研究分析, 楊寶麗[20]認為不同月份影響菌群多樣性的因素不同: 6、7、8月菌群多樣性與水溫和無機氮鹽正相關, 9月菌群多樣性與pH負相關, 但在10和11月則與pH具有正相關性; 環境因子與水體菌群多樣性的相關性大小為DOC＞無機氮鹽＞水溫＞鹽度＞pH。在本實驗中, 除9月糞便收集區外, DOC最低時的菌群豐富度普遍高于DOC最高時, 且菌群豐富度在低密度組中的變化幅度明顯高于高密度組。這說明高密度組在季節變化中更有利于菌群結構保持穩定。DOC和水溫在9和10月間差異極微, 但浮游動物卻在10月驟然增多; Pernthaler等[21]研究發現微生物群落結構受到掠食性群落的影響,這或許可以對本實驗中微生物多樣性在10月最低的結果做出合理解釋。

Villanueva等[22]研究認為, 相對于時間變換, 水體深度對菌群多樣性影響更大。宋洪寧等[23]通過16S RNA基因末端限制性片段分析技術并結合典型對應分析研究了環境因子對東平湖菌群結構的影響, 結果表明64.5、164、509、543和558 bp T-RFs的豐度與水深呈正相關。在IPRS中, 水槽前端提氣推水致不同層次的水體混合, 水深是否對菌群結構有影響還有待進一步研究。Natalie Hicks等[8]研究認為, 相對于二氧化碳或溫度的晝夜變化, 環境內的平均溫度對菌群群落組成具有顯著影響(P=0.002)。細胞外酶活性、細菌碳排放、群落呼吸等皆具有顯著的時間變化, 主要與季節溫度和基質利用率變化有關[24]。在本實驗中, 基于屬水平分析, 相對豐度前7的物種中, 5種皆與水溫的相關性極顯著(P＜0.01), 水溫的季節變化或許可以對微生物多樣性的季節變化做出合理解釋。

在本實驗中, 變形菌、放線菌、擬桿菌和藍細菌在7—11月的季節變化中始終作為優勢物種, 在對鯉魚(Cyprinus carpio)養殖塘[25]、青蟹(Scylla paramamosain)[26]、凡納對蝦[12]和團頭魴(Megalobrama amblycephala)[27]的研究中也得到了類似結論?；趯偎椒治? 假單胞菌、黃桿菌和聚球菌為優勢菌; 藍細菌、CL500-29_marine_group、hgcl_clade、Alpinimonas、分枝桿菌、MNG7和Limnohabitans為次優勢菌。其中, 假單胞菌對好氧污泥顆粒的形成和穩定運行具有重要意義[28], 還可以防止真菌病害[29], 降低重金屬危害[30], 降解苯酚[31]、硝基苯[32]、甲基對硫磷[33]等有機污染, 在水質凈化和生態調控中發揮積極作用。聚球菌在海洋中豐度極高, 對總初級生產力的貢獻可達20%以上[34]。Limnohabitans相對于其他浮游細菌細胞體積更大,因此在浮游細菌總生物量中占有較大比例[35];Limnohabitans還可以作為食物來源調控異養鞭毛蟲的生長和群落組成[36]。在本實驗中, 假單胞菌和聚球菌在不同月份中占據主要優勢, 可見水體微生態處于較好水平。但是, 分枝桿菌屬含有較多致病菌,黃桿菌為條件致病菌; 當水體富營養化時, 藍細菌還會爆發造成“水華”現象; 某些種類在代謝過程中產生多種毒素, 威脅水生動物健康。因此, 在養殖管理過程中需要對潛在風險進行防范。