人舌鱗癌耐順鉑細胞株的建立及鑒定

楊曉紅 胡小華(通信作者) 鐘雯怡 楊琨 易杰 姚禮 張立剛

563000遵義醫科大學附屬口腔醫院修復科，貴州 遵義

舌癌(tongue carcinoma)是口腔癌中最常見的惡性腫瘤，具有惡性程度高、生長快、浸潤性強、易早期發生淋巴結轉移、單純手術后易復發等特點。化學藥物治療是目前乃至將來相當長時間內舌癌的主要臨床治療手段之一，其中以順鉑為基礎的化療是臨床最常用的化療方案。然而，迄今惡性腫瘤的化療效果仍極為有限，其原因主要是絕大部分腫瘤細胞具備或產生了對化療藥物的耐受性，從而使化療藥物起不到其應有的作用[1-2]。因此，如何解決耐藥問題是抗腫瘤研究的當務之急。目前，國內口腔癌研究領域舌鱗癌的多藥耐藥細胞株較為稀有，嚴重制約及影響了口腔癌多藥耐藥機制研究。而本研究通過體外順鉑逐步增量誘導的方式，建立OSC-19的耐藥細胞株，并進行多藥耐藥性檢測及鑒定，為解決口腔癌多藥耐藥機制研究問題提供了穩定的細胞模型。

資料與方法

材料：OSC-19細胞株：購買于中科院上海細胞庫，來源于61 歲男性亞洲人舌鱗癌組織，呈上皮樣貼壁生長。試劑：DMEM 高糖培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素鏈霉素、CCK-8 試劑盒。藥品：順鉑。儀器：CO2細胞培養箱、倒置相差顯微鏡。

人舌鱗癌細胞OSC-19耐順鉑細胞株的建立：復蘇OSC-19 細胞培養于含有10%胎牛血清的DEME 高糖培養基中，置于5%CO2、37℃細胞培養箱中培養；采用濃度逐步遞增順鉑(CDDP)不間斷作用方法誘導細胞多藥耐藥，CDDP 從0.1 μg/mL 開始誘導，每個濃度點穩定生長后再增加0.1 μg/mL 濃度，最后到1.5 μg/mL CDDP 濃度后，細胞穩定生長，多藥耐藥細胞株建立后進行相關檢測。

圖1 親代OSC-19細胞及耐順鉑濃度逐步增加時的細胞形態學變化(標尺=100μm)

CCK-8 法檢測OSC-19/CDDP 細胞耐藥性：將處于對數生長期的OSC-19 和OSC-19/CDDP 細胞以6×103cells/孔的密度接種到96 孔板中，每孔含100 μL DMEM，混合均勻后，常規條件下培養24 h，使細胞貼壁。棄去每孔上清液，設置空白對照組：不加細胞僅含培養液的空白對照；陰性對照組：不加藥物僅加細胞的陰性對照；試驗組：不同濃度的順鉑(CDDP)。按照濃度梯度給予含藥物培養液100 μL，每一濃度平行5 個復孔作為試驗組。另設置5 孔只加入細胞和培養液的陰性對照組及5孔沒有加入細胞的空白對照組。培養48 h后，每孔加入10 μL CCK-8及90 μL 不含胎牛血清的培養液。37℃孵育1 h。酶標儀測450 nm處的吸光度值A。按公式1計算細胞存活率。并用GraphPad Prism 5 軟件擬合量效關系，求半數抑制濃度IC50值后按公式2計算耐藥指數(resistance index，RI)。

公式1：細胞生存率(%)=(試驗組平均A 值-空白對照組平均A 值)/(陰性對照組平均A 值-空白對照組平均A 值)×100%。公式2：RI=(OSC-19/CDDP 細胞的IC50)/(OSC-19細胞的IC50)。

統計學方法：采用SPSS 17.0 統計學軟件分析數據。計量資料用(±s)表示，采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

人舌鱗癌細胞株OSC-19與誘導耐藥過程的形態學變化：倒置顯微鏡下觀察：OSC-19細胞體積及胞核均較小，胞漿較豐富，呈均勻鋪路石狀生長(圖1A)；隨著耐順鉑濃度的增加，細胞體積及胞核均變大，胞漿中細胞顆粒增多，細胞邊緣伸出樹突狀凸起，并以此與鄰近細胞連接(圖1B～D)。

OSC-19/CDDP 細胞耐藥性檢測：經CCK-8法檢測及GraphPad Prism 5軟件擬合量效關系，得出OSC-19 及OSC-19/CDDP細胞對CDDP的半數抑制濃度(IC50)分別為4.55 μg/mL及79.06 μg/mL，耐藥指數(RI)為16.70。

討 論

腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性已成為腫瘤化療的主要障礙，探索耐藥性的產生機制，逆轉腫瘤細胞的耐藥性，是提高腫瘤化療效果的關鍵。而在體外建立穩定的耐藥細胞株模型，是細胞耐藥的實驗研究中探討耐藥分子機制的基礎。國內學者一直在努力建立穩定的口腔癌耐藥細胞系，例如利用順鉑成功誘導了口腔腺癌ACCM 的耐藥性形成和利用阿霉素持續增量誘導建立了TCA-8113舌癌耐藥株細胞[3-4]，但前者研究的是腺癌，而不是臨床常見的鱗癌；后者雖然成功形成了舌癌耐藥細胞株，但是其癌干細胞特征不明顯，而有研究表明癌干細胞可能為臨床化療耐藥的重要機制[5]，而且單一的耐藥株并不利于耐藥機制的研究，因此，我們選用來源于61 歲男性亞洲人舌鱗癌組織OSC-19細胞株作為細胞來源，以期建立另一株符合臨床實際的耐藥細胞株。

CDDP是一種細胞周期非特異性廣譜抗腫瘤藥物，DNA 是其主要靶點，與DNA結合會導致DNA損傷并誘發細胞凋亡；被廣泛用于多種腫瘤的治療，在頭頸部惡性腫瘤中單藥有效率可達25%～41%，聯合化療有效率達67%[6]；自1978年被美國食品和藥物管理局(FDA)批準使用以來，以CDDP 為主的化療方案就成為頭頸部鱗癌的一線治療方案。本研究中通過CDDP 從低濃度遞增的持續誘導方法，成功建立了生長穩定的耐藥舌鱗癌細胞株OSC-19/CDDP，通過IC50 數值的耐藥倍數比較其耐藥指數高達16.7；說明體外CDDP 濃度遞增法長時處理能夠成功誘導并建立舌鱗癌細胞株。研究中發現，隨著CDDP 濃度的增加，多藥耐藥株的形態也從親代細胞體積較小，胞核較小，胞漿較豐富，轉變為細胞體積大，胞核變大，胞漿中出現細胞顆粒增多的情況，可能是存在化療藥物經細胞排除增多，形成耐藥性的一種表現；并且細胞死亡的情況增加，細胞從鵝卵石形態變為不規則的多邊形，異質性較多，“空泡樣”細胞的形態增多。在研究中還發現，OSC-19 細胞在CDDP 從0.1 μg/mL 到1 μg/mL 的濃度遞增過程中，細胞生長穩定后增加0.1 μg/mL的藥物濃度，細胞很快能達到生長穩定狀態。但在1 ～1.5 μg/mL 濃度遞增過程中，細胞較不易達到理想生長狀態，其間存在1.2 μg/mLCDDP 濃度處理后細胞大量死亡而回調至1 μg/mL待細胞完全生長穩定后減少增加濃度至0.05 μg/mL，通過反復回調使細胞耐藥濃度穩定達到1.5 μg/mL，其原因有待進一步研究。

OSC-19/CDDP 細胞對CDDP 耐藥特性已經在體外得到了初步證實，還需在體內進一步證實其耐藥性及耐藥指數等，是否具有多藥耐藥性等亦尚需進一步實驗證實。