DLL4-Notch1信號(hào)通路與肺癌組織新生血管形成的相關(guān)性研究

張 麗，匡 黎，王 宇，王玉潔，向 瑋，權(quán)瑞泉△，楊 靖

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院：1.腫瘤科；2.兒科；3.急診科，湖北十堰 442001；4.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物免疫教研室，湖北十堰 442000)

肺癌是目前全球發(fā)病率最高的癌癥，每年全球有100多萬(wàn)人死于肺癌，其中80%以上為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[1]。NSCLC的惡性程度比較高，多數(shù)患者就診時(shí)既已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，伴隨有血管生成，失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，5年生存率低[2-3]。抗血管生成藥物給NSCLC治療帶來(lái)的生存獲益已被臨床證實(shí)[4]，但是目前研究對(duì)NSCLC相關(guān)的新生血管形成信號(hào)通路的報(bào)道較少。Delta樣配體4(DLL4)-Notch1信號(hào)通路可促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖、分化和凋亡，還有助于調(diào)節(jié)機(jī)體血管生成[5-6]。并且該通路在進(jìn)化過(guò)程中屬于高度保守的信號(hào)通路，其中Notch1受體家族有4個(gè)成員，Notch1是最常見(jiàn)的Notch1受體，在結(jié)直腸癌、胃癌中起著促癌的作用[7-8]。已有研究顯示，Notch1的過(guò)量表達(dá)可使NSCLC細(xì)胞周期阻滯在G0期，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[9-10]。基礎(chǔ)研究也顯示，Notch1在正常早期小鼠肺內(nèi)均有表達(dá)，其在小鼠肺中的表達(dá)量隨年齡增長(zhǎng)而增加，在肺發(fā)育中發(fā)揮重要作用[11]，但是與新生血管形成的研究還鮮有報(bào)道。本文具體探討DLL4-Notch1信號(hào)通路與NSCLC組織新生血管形成的相關(guān)性，希望為NSCLC的診斷、評(píng)價(jià)、治療提供思路與參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2009年8月至2017年2月保存于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院病理科的肺癌組織標(biāo)本56例(肺癌組)與癌旁組織標(biāo)本(離肺癌腫塊>5.0 cm的肺組織)56例(癌旁組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床病理資料完整，每例患者都保存有肺癌組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本；病理確診為NSCLC，患者術(shù)前均未行放、化療及其他抗腫瘤治療；年齡20～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床與病理資料缺乏者；合并嚴(yán)重性心臟瓣膜病、先天性心臟病患者。56例患者中男30例，女26例；年齡22～78歲，平均(63.22±2.19)歲；病理類(lèi)型：鱗狀細(xì)胞癌50例，腺癌6例；分化類(lèi)型：高分化6例，中分化35例，低分化15例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例；臨床分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期19例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例；平均病程(4.10±0.22)年；平均體質(zhì)量指數(shù)(22.47±1.48)kg/m2。

1.2免疫組織化學(xué)分析 兔/鼠抗人多克隆抗體(抗DLL4抗體、抗Notch1抗體)、PBS緩沖液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，羊抗鼠/兔IgG 聚合物(二抗)、DAB顯色劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。所有組織標(biāo)本均經(jīng)4%中性福爾馬林固定，石蠟包埋組織以4 μm厚連續(xù)切片。60 ℃烘烤，二甲苯、乙醇脫蠟水化，高壓熱修復(fù)，3%H2O2滅活。免疫組織化學(xué)染色步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，抗DLL4抗體、抗Notch1抗體工作濃度為1∶500，37 ℃孵育1 h，二抗于室溫下作用10 min(工作濃度1∶2 000)，DAB 顯色3～5 min，蘇木素對(duì)比染色，封片后在鏡下觀察分析結(jié)果。免疫組織化學(xué)染色步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以PBS液代替一抗作空白對(duì)照，用已知陽(yáng)性片作對(duì)照。

1.3判斷標(biāo)準(zhǔn) 所有免疫組織化學(xué)結(jié)果最后由2位病理醫(yī)師采用獨(dú)立雙盲法閱片判定。DLL4、Notch1均以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。著色強(qiáng)度：0分，無(wú)色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。著色范圍：0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比<10%；1分，11%～50%；2分，51%～75%；3分，>75%。將著色強(qiáng)度得分和著色范圍得分的乘積作為判斷結(jié)果，總得分≤2為陰性，總得分>2為陽(yáng)性。

1.4調(diào)查內(nèi)容 本研究調(diào)查了患者的一般資料與新生血管形成狀況，包括年齡、性別、臨床分期、病程、分化類(lèi)型、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、體質(zhì)量指數(shù)、新生血管形成等。

2 結(jié) 果

2.1DLL4-Notch1表達(dá)情況對(duì)比 肺癌組的DLL4與Notch1陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.1%和14.3%，癌旁組分別為7.1%和32.1%，DLL4、Dotch1在2組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1與圖1。

表1 2組DLL4-Notch1表達(dá)情況對(duì)比[n(%)]

2.2新生血管形成情況 在56例患者中，病理表現(xiàn)為新生血管形成30例，其DLL4與Notch1陽(yáng)性表達(dá)率分別為96.7%和1.3%，與非新生血管形成(1.3%和26.9%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

注：A、B表示DLL4；C、D表示Notch1

圖1肺癌組DLL4-Notch1的免疫組織化學(xué)表達(dá)

表2 肺癌組中新生血管形成的DLL4、Notch1陽(yáng)性表達(dá)率比較[n(%)]

2.3相關(guān)性分析 在肺癌組中，Spearman相關(guān)分析顯示，新生血管形成與DLL4表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.734，P=0.000)，與Notch1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.795，P=0.000)。

2.4影響因素分析 在肺癌組中，以新生血管形成為因變量，將調(diào)查資料、免疫組織化學(xué)結(jié)果等因素作自變量，多因素非條件Logistic 回歸分析顯示,DLL4表達(dá)、Notch1表達(dá)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化均為影響新生血管形成的因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 影響肺癌患者新生血管形成的多因素分析結(jié)果(n=56)

3 討 論

肺癌是目前全球發(fā)病率最高的癌癥，NSCLC約占肺癌總數(shù)的80%。NSCLC患者的5年生存率很低，術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是主要原因[12-13]。本研究顯示，肺癌組的DLL4與Notch1陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.1%和14.3%，癌旁組分別為7.1%和32.1%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Notch1的過(guò)量表達(dá)可以引起NSCLC細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。Notch1在腫瘤組織中的表達(dá)與具有促癌作用的DLL4 因子均呈負(fù)相關(guān)，提示Notch1可能存在抑制NSCLC生長(zhǎng)的趨勢(shì)[14-15]。

腫瘤的生長(zhǎng)與腫瘤的血管生成密切相關(guān)，新生血管形成可以與機(jī)體血液循環(huán)相通，使得腫瘤組織能得到更好的血液供應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲[16]。本研究結(jié)果顯示，在56例患者中，病理表現(xiàn)為新生血管形成30例，其DLL4與Notch1陽(yáng)性表達(dá)率分別為96.7%和1.3%，與非新生血管形成(1.3%和26.9%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明有新生血管形成的NSCLC具有更高的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，臨床上表現(xiàn)為患者預(yù)后很差。新生血管形成的特點(diǎn)為管道內(nèi)沒(méi)有血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，腫瘤細(xì)胞模仿機(jī)體血管生成而形成瘤細(xì)胞條索并圍成管道[17]。病理學(xué)顯示分化程度越低，新生血管形成的陽(yáng)性率越高，腫瘤的惡性度越高[18]。而DLL4與Notch1的表達(dá)都可調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的分化，特別是DLL4高表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞比例減低，抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成，促進(jìn)細(xì)胞分化和凋亡[19]。當(dāng)前也有研究顯示，Notch1具有很強(qiáng)的致瘤、血管侵襲能力；在增殖過(guò)程中，Notch1可能會(huì)分泌某種化學(xué)因子，使得腫瘤細(xì)胞具有新生血管的微環(huán)境，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)血管的發(fā)育和成熟[20]。

腫瘤的生長(zhǎng)與腫瘤的血管生成密切相關(guān)，抗血管生成已經(jīng)是當(dāng)前腫瘤治療研究的新方向。DLL4-Notch1信號(hào)通路是影響腫瘤血管生成的重要信號(hào)通路，DLL4是唯一特異性存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的Notch1配體，可調(diào)控血管萌發(fā)和分支的形態(tài)[21]。DLL4只存在于內(nèi)皮細(xì)胞的表面，在腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)；阻斷DLL4信號(hào)，起到協(xié)同抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[22]。Notch1受體是目前Notch信號(hào)通路中研究最多的受體，其通過(guò)鄰近細(xì)胞間的相互作用來(lái)調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為；Notch1的異常活化可能使細(xì)胞過(guò)度增殖和侵襲[23]。本研究Spearman相關(guān)分析顯示，肺癌組織的新生血管形成與DLL4表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.734，P=0.000)，與Notch1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.795，P=0.000)；多因素非條件Logistic 回歸分析顯示,DLL4表達(dá)、Notch1表達(dá)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分化均為影響新生血管形成的因素(P<0.05)，表明DLL4-Notch1信號(hào)通路異常可能參與NSCLC的病理學(xué)分化等，該通路的異常表達(dá)可促進(jìn)新生血管形成和腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[24]。但是抗新生血管形成治療并不是對(duì)所有NSCLC都有效，有的NSCLC雖然在治療初期有效，但在治療過(guò)程中可以發(fā)展為耐藥，因此，有必要研究更多的影響新生血管形成的信號(hào)通路，尋找新的血管治療靶點(diǎn)，從而改善患者的預(yù)后[25]。

4 結(jié) 論

DLL4-Notch1信號(hào)通路在NSCLC的形成中起重要作用。DLL4-Notch1信號(hào)通路促進(jìn)新生血管形成是NSCLC組織發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件，可作為評(píng)估NSCLC患者臨床特征與轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。