重組人脂蛋白相關磷脂酶A2的原核表達及單克隆抗體制備

歐蘭香，陳 振，王佳穎，解光寧，王 巖 ，朱之煒△

(1.山東萊博生物科技有限公司，山東濟南 250100；2.山東省體外診斷用免疫原料制備與標記工程技術研究中心，山東濟南 250100)

脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)是近年來一種被廣泛關注的新型炎癥標志物。Lp-PLA2蛋白包含441個氨基酸，相對分子質量為45.5×103[1]，由PLA2G7基因編碼[2]，該基因由12個外顯子組成，位于人類6號染色體的6p12-p21.1區段。Lp-PLA2是一類不依賴于鈣離子的磷脂酶，能夠降解氧化磷脂，并將它們降解為溶血磷脂及氧化游離脂肪酸等。這些降解產物會刺激機體分泌細胞因子和黏附因子，進而導致血管內皮功能異常[3-4]，最終形成早期動脈硬化斑塊。檢測血液中的Lp-PLA2水平，能夠幫助預測冠心病或缺血性卒中的發生[5-6]。本研究通過構建Lp-PLA2原核表達載體，通過誘導、純化獲得人Lp-PLA2重組蛋白，并通過重組抗原免疫得到Lp-PLA2的單克隆抗體，為后續Lp-PLA2免疫檢測試劑盒的開發奠定基礎。現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒、菌株 質粒pET32a(+)、大腸桿菌DH5α、Rosetta(DE3)菌株由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑 人單核細胞(THP-1)cDNA表達文庫為本實驗室前期構建；pEASY-T1 Cloning Kit購自北京全式金生物技術有限公司，Prime STAR高保真Taq酶，T4 DNA連接酶，限制性內切酶NotⅠ、SalⅠ，DNA凝膠回收試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；弗氏完全佐劑與不完全弗氏佐劑、降植烷、PEG4000、HAT條件培養基購自Sigma公司；Protein A購自美國GE公司；小鼠單抗Ig類/亞類鑒定試劑盒購自洛陽佰奧通實驗材料中心；酶標板購自廈門云鵬科技發展有限公司。

1.1.3實驗動物 Balb/c小鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2方法

1.2.1Lp-PLA2基因的獲得 在美國國立生物技術信息中心(NCBI)上檢索得到人Lp-PLA2基因序列，并設計特異性引物在上、下游兩端分別添加NotⅠ、SalⅠ酶切位點，引物序列見表1。以人類cDNA文庫為模板，對PLA2G7基因進行擴增。反應程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 60 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 80 s，35個循環；72 ℃ 5 min。通過電泳，回收1 275 bp的目的片段，與pEASY-T1中間載體進行連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將菌液涂布于含有卡那霉素的LB固體培養基上，37 ℃培養過夜。挑取單克隆，擴大培養后提取質粒，進行PCR和酶切鑒定，將篩選得到的陽性克隆送濟南博尚生物有限公司進行測序。

表1 PLA2G7基因擴增引物序列

1.2.2原核表達質粒pET32-PLA2G7的構建 使用NotⅠ、SalⅠ分別對pEASY-PLA2G7與pET32a(+)進行雙酶切，回收目的基因片段與原核表達載體片段，按照摩爾比3∶1的比例進行混合，16 ℃連接3 h，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將菌液涂布于含有卡那霉素的LB固體培養基上，37 ℃培養過夜。挑取單克隆，擴大培養后提取質粒，進行PCR和酶切鑒定，陽性克隆送濟南博尚生物有限公司進行測序鑒定。提取質粒后，再轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態細胞。

1.2.3重組人Lp-PLA2蛋白的表達 將保存于-80 ℃的pET32a(+)-PLA2G7菌液取出，接種于LB培養基中，37 ℃培養過夜。按照萬分之一的比例將菌液集中于誘導培養基(NaCl 9 g，蛋白胨11 g，酵母提取物22 g，甘油4 mL，卡那霉素0.1 mg/mL)中，37 ℃培養3 h，至吸光度(A)600在0.5～0.8時，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導蛋白表達，30 ℃繼續高速振蕩培養7 h。5 000 r/min離心10 min收集菌體，經超聲破碎后再離心，分離獲得上清液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測蛋白表達情況。

1.2.4重組人Lp-PLA2的純化和鑒定 使用親和鎳柱層析法對含有Lp-PLA2的上清液進行初步純化。洗脫緩沖液：Tris 20 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，咪唑500 mmol/L，甘油 10%，CHAPS 0.6% W/V，pH 8.5。初純液通過經GE-DEAE柱進行NaCl梯度洗脫，收集洗脫組分，再經過P-6DG柱進行脫鹽，收集洗脫組分。將得到的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，通過半干法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉3 h后；與兔抗人Lp-PLA2抗體(1∶1 500倍稀釋)進行雜交，28 ℃孵育3 h；取出硝酸纖維素膜，漂洗后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶5 000倍稀釋)，室溫孵育1 h；漂洗后使用ECL進行顯色。

1.2.5Lp-PLA2單克隆抗體的制備 將制備得到的重組人Lp-PLA2與等體積的完全弗氏佐劑充分混合，對Balb/c小鼠進行皮下多點注射(50 μg抗原/只)。4周后測定血清效價，選擇免疫反應好的個體加強免疫，將抗原與不完全弗氏佐劑充分混合后，通過皮下多點注射(25 μg抗原/只)，連續進行6次再免疫，細胞融合前連續加強免疫2次；之后取脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞進行融合。融合細胞在37 ℃培養9～11 d，待培養孔中生長出較大的細胞克隆后，進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA)篩選；將陽性克隆進行有限稀釋后，進行4次克隆化培養，保存細胞。按照0.5 mL/只的劑量使用降植烷處理小鼠，1周后在腹腔內接種雜交瘤細胞(2×106細胞/只)，飼養10 d后收集腹水。腹水經硫酸銨沉淀后，使用Protein A進行親和純化。

1.2.6重組人Lp-PLA2單抗隆抗體的鑒定 用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將重組人Lp-PLA2稀釋到0.25 μg/mL，包被酶標板，4 ℃過夜。第2天取出酶標板，按照小鼠單抗Ig類/亞類鑒定試劑盒說明書流程，對純化得到的不同單克隆抗體進行亞類鑒定。為了挑選包被抗體和檢測抗體的最佳組合，將不同單克隆抗體分別包被酶標板和酶(HRP)標記，進行兩兩配對的ELISA檢測，篩選最佳抗體組合。用稀釋液將純化后的抗體進行倍比稀釋，通過ELISA法檢測抗體效價，對照為10 000倍稀釋后的小鼠免疫前血清。用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將人Lp-PLA2單克隆抗體稀釋，包被酶標板，4 ℃過夜。第2天取出酶標板，TSBT洗滌1次，5%BSA溶液37 ℃封閉2 h；每孔分別加入純化后的Lp-PLA2及C反應蛋白、纖維蛋白酶原的標準品，37 ℃孵育1 h。孵育完成后取出酶標板，TBST洗滌3次，分別加入標記了HRP的人Lp-PLA2單克隆抗體100 μL(1∶4 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。TBST洗滌5次，加入TMB底物，37 ℃顯色20 min。取出后加終止液，在酶標儀上測定A450讀數，分析所制備的單克隆抗體的特異性。

2 結 果

2.1原核表達質粒的鑒定 以人THP-1 cDNA文庫為模板，利用特異性引物擴增得到PLA2G7基因片段，見圖1。與pEASY-T1連接后送公司進行測序；確定片段正確后，用于構建pET32a(+)-PLA2G7質粒。使用NotⅠ、SalⅠ對已構建的重組質粒pET32-PLA2G7電泳后分離得到5.4 kb的載體片段及1 257 bp的目的序列片段，見圖2。經測序，PLA2G7片段無堿基突變，與NCBI已公布的基因編碼序列一致，說明載體構建成功，可用于后續實驗。

注:M表示DL2000 DNA marker

圖1 PLA2G7基因PCR擴增圖

2.2重組人Lp-PLA2的表達、純化與鑒定 經過條件摸索，在本研究中，重組Lp-PLA2優化表達體系如下：37 ℃培養條件下，A600為0.5～0.8時，加入0.2 mmol/L的IPTG，30 ℃培養7 h，重組人Lp-PLA2能夠在DE3中以可溶蛋白的形式大量表達。經SDS-PAGE電泳檢測，重組蛋白約為47×103,與理論值基本一致，蛋白在上清中表達量最高，占菌體總蛋白的50%左右，見圖3。這表明重組蛋白能夠在大腸桿菌中穩定表達，能夠用于后續實驗。將純化后的重組人Lp-PLA2通過SDS-PAGE電泳將蛋白分離，通過半干法轉印至硝酸纖維素膜上，與商業化的Lp-PLA2抗體雜交，顯色后在47×103處出現特異性條帶，見圖4，這表明純化后的重組人Lp-PLA2具有較好的免疫學活性。

注:M表示DL2000 DNA marker;1～2表示pET32a(+)-PLA2G7質粒NotⅠ與SalⅠ雙酶切產物

圖2 pET32-PLA2G7酶切電泳圖

注：A圖中M表示蛋白分子量標準，1表示未經IPTG誘導菌液，2表示IPTG誘導后的菌液，3表示沉淀，4表示上清；B圖中M表示蛋白分子量標準，Lp-PLA2表示純化后的重組人Lp-PLA2

圖3重組人Lp-PLA2的表達和純化

圖4 重組人Lp-PLA2的蛋白免疫印跡檢測

2.3重組人Lp-PLA2單克隆抗體的鑒定 經過一系列篩選，共得到5株單克隆抗體(1D7、2A3、2E6、5F1和6H12)，經過蛋白免疫印跡驗證，它們都能特異性識別Lp-PLA2蛋白，見圖5。使用抗體分型試劑盒對所述單克隆抗體進行亞型鑒定，其中1D7、2E6、5F1和6H12為IgG2b亞型，輕鏈為κ鏈，2A3為IgG2a亞型，輕鏈為λ鏈。對5株抗體進行兩兩配對的雙抗體夾心ELISA檢測分析顯示，使用2E6作為包被抗體、5F1為檢測抗體時，具有較高的檢測靈敏度，見表2。通過間接ELISA法檢測，本實驗所制備得到的Lp-PLA2抗體效價可達1∶2×106以上，見圖6。將該抗體包被酶標板，對Lp-PLA2蛋白、纖維蛋白原、C-反應蛋白進行ELISA檢測，發現抗體不會與纖維蛋白原、C-反應蛋白等發生交叉反應，具有較好的特異性，見圖7。

表2 單克隆抗體的配對篩選

注：—表示未進行此組檢測

注：M表示蛋白分子量標準；-表示:pET32a(+)空白質粒陰性對照

圖5 Lp-PLA2單克隆抗體的蛋白免疫印跡檢測

圖6 Lp-PLA2抗體效價分析

圖7 Lp-PLA2單克隆抗體與其他心血管標志物的交叉反應性

3 討 論

心血管疾病是一種在全球范圍內危及人類生命安全的疾病，其發生、發展與動脈硬化的產生具有密不可分的關系，而Lp-PLA2在動脈硬化斑塊形成過程中又發揮了重要作用[7-9]。在體內，Lp-PLA2與高密度脂蛋白和載脂蛋白A1呈負相關[10]。Lp-PLA2能夠水解磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等甘油酸脂的sn-2位磷脂鍵[11]，產生游離型氧化脂肪酸和溶血卵磷脂。因此，又被稱為血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)[12]。Lp-PLA2的水解產物很多都能夠刺激炎性因子，如細胞黏附因子、細胞因子等的產生，引發血管內皮損傷，使得黏附在內皮細胞上的單核細胞數量增加，血管內皮通透性改變，當單核細胞通過受損內皮進入血管內膜后，會形成巨噬細胞并吞噬氧化型低密度脂蛋白，產生動脈粥樣硬化斑塊；巨噬細胞分泌的炎性因子也會加速動脈硬化斑塊的形成。2005年美國食品藥品管理局已批準將Lp-PLA2作為動脈硬化和缺血性卒中的風險評價因素[5]。

目前，已有課題組利用DNA重組技術在不同生物(如大腸桿菌、昆蟲、酵母)中進行過Lp-PLA2的表達研究，但存在不表達或表達量較低的情況[13]。在本研究的前期實驗過程中發現Lp-PLA2主要以包涵體的形式被分泌出來。通過使用含有硫氧還蛋白(trxA)和便于蛋白生產、純化的雙融合伴侶原核表達載體pET32a[14]，從而增加重組Lp-PLA2的可溶性。使用相對較低的溫度(30 ℃)誘導蛋白表達，并在培養基中適當提高抗菌藥物水平(0.1 mg/mL的卡那霉素)，這些方式也有助于提高外源蛋白表達水平[15]。

4 結 論

本研究獲得大量高純度的人Lp-PLA2重組蛋白，并通過該蛋白免疫得到對應的具有高特異性的單克隆抗體，為后續Lp-PLA2檢測試劑盒的開發奠定了基礎。