血清APE1蛋白檢測在食管癌診斷中的價值

羅家敏，戴 楠，陳 川，楊宇馨，張詩珩，熊艷麗，單錦露，王 閣，李夢俠，王 東

(中國人民解放軍陸軍特色醫學中心腫瘤中心，重慶 400042)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，在我國發病率和病死率分別位居第6位、第4位[1]。早期食管癌預后較好，5年生存率>90%[2]，但因早期食管癌癥狀多不典型，易被忽略，大多患者就診時已為晚期，5年生存率為15%～25%[3]。因此，早發現、早診斷、早治療是食管癌臨床診治的關鍵。目前，食管癌的診斷主要依賴內鏡下組織病理學檢查，但由于其屬于侵入性檢查且檢查費用較高，不適用于臨床篩查。血清腫瘤標志物容易獲取，且在某些腫瘤患者中具有較高的靈敏度及特異度，成為篩查及早期診斷惡性腫瘤的一個重要輔助手段。目前，食管癌常用的血清腫瘤標志物有鱗狀細胞抗原(SCCA)、糖類抗原19-9(CA19-9)、細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原242(CA242)等。然而，由于它們診斷靈敏度和特異度較低，在早期食管癌檢測中的價值有限，所以，有待尋求具有更高診斷靈敏度和特異度的新型腫瘤標志物。

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶 1(APE1)是廣泛存在于人體組織中的一種多功能酶。它不僅是參與DNA損傷后堿基切除修復途徑的限速酶，亦具有氧化還原功能，調控人體多種重要細胞轉錄因子活性[4-5]。研究發現，APE1的調節異常與癌癥的發生、發展及預后相關，在肺癌、肝癌、結腸癌、食管癌等多種惡性腫瘤組織中均發現APE1的高表達[6-12]。然而，關于惡性腫瘤患者血清中APE1水平的研究較少。KATSUMATA等[13]首次在系統性紅斑狼瘡患者血清中發現APE1抗體水平明顯高于健康對照組。基于該發現，本實驗組推測APE1蛋白在其他病理狀態的患者血清中亦可能存在高表達，并進行相關研究發現在非小細胞肺癌患者血清中存在APE1蛋白及其抗體的高表達，且其表達水平與化療療效相關[14]。因此，本研究通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測食管癌患者血清中APE1水平，并運用Logisitic回歸和受試者工作特征曲線(ROC曲線)等統計方法，分析APE1聯合CEA、CA19-9和CA242后的診斷效能，以探討血清APE1蛋白檢測在食管癌診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年1月至2012年8月本院共297例食管癌患者(病例組)血清，其中男255例，女42例，年齡41-85歲，中位年齡65歲，所有患者均為經組織病理學確診的初治患者，并排除合并嚴重創傷、感染、自身免疫疾病及半年內手術史、其他惡性腫瘤病史患者。另同期收集312例體檢健康人群血清作為對照組，其中男104例，女208例，年齡25～89歲，中位年齡62歲。收集兩組人群性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤家族史、臨床TNM分期等相關臨床資料。297例食管癌患者與312例健康對照人群年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤家族史差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

1.2血清APE1檢測 所有標本為受試者清晨空腹靜脈血，室溫凝血后以3 000 r/min離心10 min，收集無溶血的血清標本，-80 ℃條件貯存。實驗采用血清APE1定量檢測試劑盒,由本實驗室與天津華博特生物科技有限公司聯合研發，實驗具體步驟如下。(1)配制蛋白標準品：蛋白原液3.1 mg/mL，配制液為試劑盒提供的封閉緩沖液，水平為0.0、0.1、0.4、1.6、4.0、8.0 ng/mL。(2)孵育血清：分別將蛋白標準品與待測血清原液加入微孔板，平板振蕩，隨后在37 ℃恒溫箱中蓋板孵育，時間為60 min。(3)洗板：倒掉反應液后每孔以200 μL清洗液洗板5次，并控干孔內殘液。(4)每孔加入100 μL酶結合物并振蕩混勻，37 ℃恒溫箱中蓋板孵育60 min。(5)同步驟3洗板。(6)加底物液：每孔加入100 μL混合后的底物液顯色，37 ℃恒溫箱中溫育15 min。(7)終止及讀值：每孔加入終止液50 μL進行終止，終止反應后10 min內在測定波長450 nm、參比波長620 nm條件下測定吸光度值。利用插值法(0ringin9.0 軟件)計算血清APE1水平。

表1 病例組與對照組一般臨床資料[n(%)]

1.3血清CEA、CA242、CA19-9檢測 所有血清均采用本院常規腫瘤診斷蛋白芯片試劑盒進行檢測，試劑盒購自浙江湖州數康生物科技有限公司。正常參考范圍如下：血清CEA<5 ng/mL，CA19-9<37 U/mL，CA242<20 IU/mL。檢測結果高于正常參考值時判定為陽性病例。APE1聯合其他腫瘤標志物檢測時，結果中只要有一項為陽性，該樣本即判定為陽性。

2 結 果

2.12組人群血清APE1水平差異 病例組血清APE1水平范圍為0～6.379 0 ng/mL,中位水平為0.322 6 ng/mL，對照組血清APE1水平范圍內0～1.374 2 ng/mL,中位水平為0.215 1 ng/mL，病例組的血清APE1水平明顯高于對照組(P<0.001)。

2.2繪制ROC曲線評價血清APE1在食管癌診斷中的價值 分別繪制血清APE1、CA19-9、CEA及CA242的ROC曲線，APE1的曲線下面積(AUC)最大，為0．661(95%CI:0.616～0.706)。其次是CEA，AUC為0.620(95%CI:0.574～0.665),見圖1A。APE1的臨界值值為0.32 ng/mL，此時APE1診斷食管癌的靈敏度為50.2%，特異度為91.9%。利用Logistic回歸模型，計算血清APE1聯合CEA、CA19-9及CA242的診斷預測概率，APE1與CEA及CA242聯合后的AUC較單一指標升高，其中APE1與CEA聯合后AUC最大,為0.739(95%CI：0.696～0.781)，見圖1B。

注：A表示血清APE1、CEA、CA19-9、CA242的ROC曲線；B表示血清APE1與CEA、CA19-9 、CA242分別聯合的ROC曲線

圖1單獨和聯合檢測的ROC曲線

2.3病例組血清APE1水平與臨床因素的相關性 分析297例食管癌患者血清APE1水平與性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤家族史及TNM分期的相關性，結果顯示Ⅲ+Ⅳ期患者的血清APE1水平顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者，提示血清APE1水平與TNM分期關系密切，而與性別、年齡等其余臨床因素無相關性。見表2。

表2 病例組血清APE1水平與臨床因素的相關性

2.4多因素Logistic回歸分析食管癌患者的血清APE1水平 納入年齡、性別、吸煙史、飲酒史、家族史行多因素Logistic回歸分析，結果表明血清APE1、CEA水平和年齡是食管癌發病的危險因素，APE1的OR值為25.646(95%CI:10.179～64.617)；CEA的OR值為1.262(95%CI:1.158～1.374)；年齡的OR值為1.086(95%CI:1.064～1.109)。

2.5APE1、CEA、CA19-9及CA242對食管癌診斷效能的比較 CA242在食管癌診斷中靈敏度最高，但特異度較低。APE1診斷靈敏度及特異度其次，但其準確度在各單項指標中位居第一。APE1與CEA、CA19-9、CA242聯合后，靈敏度及準確度有所升高，特異度有所下降,見表3。

3 討 論

惡性腫瘤的早發現、早診斷是影響預后的重要因素，目前食管癌的早期診斷主要依靠有創性的內鏡檢查，操作不便且價格昂貴，尋求一種易于檢測且靈敏度高的腫瘤標志物成為研究熱點。APE1作為DNA損傷修復途徑的重要限速酶，近年來，已有多項研究證實其在非小細胞肺癌、結腸癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、骨肉瘤、食管癌等多種惡性腫瘤組織中存在異常表達，表現為表達水平增高及胞質異位表達，因而APE1被認為是多種惡性腫瘤的組織標志物。筆者推測，APE1異常表達的腫瘤組織，在大量腫瘤增殖、凋亡、壞死的過程中，細胞分泌或裂解釋放APE1蛋白入血，從而可能從血清中檢測到異常表達的APE1蛋白。本研究檢測297例食管癌患者和312例體檢健康者血清APE1蛋白水平，發現食管癌患者血清APE1水平顯著高于健康對照人群，提示檢測食管癌患者血清APE1水平可輔助診斷食管癌。且運用ELISA方法進行檢測，較組織病理學檢查具有快速、簡便、重復性高、費用低廉的優點。另外，本研究發現APE1水平與腫瘤分期密切相關，Ⅲ+Ⅳ期食管癌患者的APE1水平顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者，這可能與晚期患者腫瘤負荷更大，腫瘤細胞凋亡、壞死更多有關。

本研究中，血清APE1單獨診斷食管癌的靈敏度為50.2%，特異度為91.9%，準確度為67.8%，提示血清APE1可作為食管癌較為優秀的血清學診斷指標。進一步分析APE1聯合CEA、CA19-9及CA242檢測，聯合后雖診斷特異度有所下降，但靈敏度與準確度提高，提示APE1和現有的腫瘤標志物聯合檢測可以提高食管癌的診斷效能，但仍需更大樣本量的驗證以確定最佳聯合檢測模式及APE1最佳參考值范圍。

我國食管癌以食管鱗癌為主，既往研究證實SCCA、CYFRA21-1在食管鱗癌患者血清中表達升高，但其診斷食管癌的靈敏度較低，分別為32.0%和47.9%[15]。參考既往研究提示其診斷靈敏度欠佳，故在本研究中未將SCCA、CYFRA21-1列入。根據本研究結果提示APE1與CEA、CA19-9等聯合檢測可提高診斷效能這一趨勢，推測APE1與SCCA、CYFRA21-1聯合檢測食管癌亦可能較單獨檢測更具優勢，在未來的研究中可行進一步探討。本實驗尚未獲得食管癌患者治療效果及生存期等相關數據，血清APE1是否可作為食管癌患者治療反應監測及預后判斷的輔助參考指標，仍待進一步研究。

4 結 論

血清APE1蛋白對食管癌的診斷具有輔助作用，與CEA、CA242、CA19-9聯用可提高對食管癌的診出率。