改良比色法在全自動生化分析儀加樣重復性與準確度校準中的應用

王志偉，蔡永梅，毛東英，劉 京，楊 萍，王利新△，閆 鵬

(1.寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心，寧夏銀川 750004；2.西門子醫學診斷產品(上海)有限公司，上海 200120)

樣本和試劑加注重復性和準確度測定是全自動生化分析儀校準過程中的難點[1]，采用稱量法需控制儀器試劑針或樣品針將特定體積的液體轉移至指定容器，用電子天平稱量并計算所轉移液體的體積[2]。然而,多數全自動生化分析儀并不支持上述液體轉移的特定測試序列且在實驗室環境進行微量稱量受干擾因素較多，可操作性差。傳統的比色法理論上可對樣本的加注情況進行測定，然而主流的全自動生化分析儀首先加入比色杯的是試劑一而不是樣本，且兩者加注間隔時間非常短，采用比色法對其中之一進行測定難度很大。比色法通過加注、回收和定容，稀釋所加注色素原液、確定稀釋倍數，測定稀釋后色素原液與內標物吸光度，計算色素原液加注體積。基于此，筆者對比色法進行改良，在全自動生化分析儀設定特定的檢測程序，對吸光度已知的標準物質進行稀釋，測量稀釋后的吸光度并與理論吸光度值進行對照，測定樣本和試劑加注的重復性與準確度。現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 西門子ADVIA 2400全自動生化分析儀；BW 2025-1生化分析儀校準用溶液標準物質-吸光度[3-4]，由中國計量研究科學院提供。

1.2方法

1.2.1參數設置 在西門子ADVIA 2400全自動生化分析儀開放通道按表1要求定義檢測方法。其中ORIGI-1對標稱為0.981A的生化分析儀校準用溶液標準物質-吸光度BW 2025-1進行測定，確定標準物質在該儀器檢測時的準確吸光度；S-25、S-5和S-2分別對25、5、2 μL的樣本加注量進行測量；D-STD和D-SPE分別對30、5 μL原樣量加注、稀釋情況進行測量；R1-50和R2-10對試劑一常用加注量50 μL及試劑二常用加注量10 μL進行測量。見表1。

1.2.2水參比測試 不同稀釋條件下測定BW 2025-1吸光度均以去離子水作參比，因此，確認項目參數設置無誤后，同時以去離子水為試劑和樣本運行所有項目定標，獲得水參考吸光度。注意，不能以試劑空白代替水參考。見表2。

1.2.3獲取吸光度 正確獲取水參比后，按表2所示要求放置樣本和試劑，運行所有檢測項目20次，讀取吸光度值。表中標準物為BW 2025-1，稀釋液為0.05 mol/L硫酸。

2 結 果

讀取各測試程序吸光度值后，分別計算其均值、標準差及變異系數，評估試劑和樣本加注的重復性，所有測試項目變異系數均處于2% 的允許變化范圍之內[2]。根據BW 2025-1在儀器測定均值及BW 2025-1被稀釋的比例計算各測試項目的理論吸光度值，結合各項目20次測定均值計算誤差，評估試劑和樣本加注的準確度，所有測試項目誤差均處于±5%的允許范圍內[2],試驗儀器樣本與試劑加注的重復性和準確度均滿足要求，見表3。

表1 測試方法參數設置

表2 各測試方法樣本、試劑要求

表3 各測試方法吸光度重復性與準確度

續表3 各測試方法吸光度重復性與準確度

注：-表示此項無數據

3 討 論

不同生化分析儀比色杯光徑存在差異，標準物質上機檢測時讀取的吸光度亦不同[5-6]。在進行加樣準確度和重復性測試前應當設置程序獲得標準物質實測吸光度值，該測定結果不依賴于試劑或樣本加注的準確度和重復性，且20次測定的變異系數應當小于1.50%[2]。所有測試程序加注液體的總量均不得低于儀器最小標稱反應體積。改良的比色法實質是將標準物質BW 2025-1按照特定比例稀釋檢測吸光度，稀釋倍數不宜過大，稀釋倍數過大(如大于50倍或100倍)導致BW 2025-1過度稀釋，獲得的吸光度值過低、接近儀器吸光度分辨率而產生測量誤差。BW 2025-1的基體為0.05 mol/L硫酸，不宜用去離子水作為稀釋劑。實際上，也可用吸光度已知、狀態穩定的染料或色素原液代替標準物質BW 2025-1，對傳統的比色法進行改良，實現全自動生化分析儀樣本與試劑加注準確度和重復性的測試。在進行樣本(或試劑)加注測試時，應當將試劑(或樣本)的加注量設為最大，降低不確定度的引入；在進行儀器最小加樣量測試時，應當兼顧最小反應體積和稀釋比例，合理設置參數。運行測試前進行水參比測試也是必須的，否則測得的吸光度與稀釋倍數不相關，無法進行加注準確度判斷。為避免溫度和放置時間對標準物質BW 2025-1影響，所有測試均應盡可能在同一時間、同一批次完成。

校準前應當對生化分析儀作必要的維護[7]，如檢查液體管路，更換注射器密封組件，必要時更換樣本或試劑針，確保儀器工作狀態良好；樣本加注重復性和準確度測試點(校準點)選擇25 μL(最大)、2 μL(最小)及5 μL；樣本稀釋重復性和準確度測試點(校準點)選擇30 μL(30∶150，STANDARD，常用)及5 μL(5∶75，微量)；試劑加注重復性和準確度測試點(校準點)選擇試劑1常用加注體積50 μL及試劑2常用加注體積10 μL。所有校準點的選擇須兼顧樣本或試劑的常用加注體積以保證校準測試的有效性。該方法除用于定期校準測試外，還可用于生化分析儀樣本或試劑分配系統故障的排查，亦可結合反應曲線對試劑混勻情況進行測試。

生化分析儀加樣準確度與重復性測試的首選方法是稱量法，但是稱量法實現的前提是儀器能夠提供特定的測試程序予以支持，加之受實驗室的環境、稱量設備、人員素質等因素的限制，稱量法在實驗室實施并不可行且操作不當有可能引入很大的不確定度，不能真正考察儀器試劑和樣本的加注準確度和重復性[3,8-9]。采用改良比色法，只需設定測試程序、運行實驗、統計分析數據即可完成生化

分析儀加樣系統的校準，對人員、環境條件、設備等要求較低，簡單易行[8,10]。

4 結 論

合理設置分析方法，使全自動生化分析儀按照特定比例對標準物質BW 2025-1進行稀釋，改良傳統比色法，可實現全自動生化分析儀試劑與樣本加注重復性和準確度的測試、評估(校準)。該方法簡單、便于操作，受影響因素少，可操作性強[9-10]。