應用一致性檢驗對泌尿系結核3種檢測方法的評估

張昭勇，楊宏偉，張吉才

(十堰市太和醫院/湖北醫藥學院附屬醫院檢驗部，湖北十堰 442000)

結核是由結核分枝桿菌引起的一種傳染病，目前仍然是全球最關注的公共衛生問題。2018年WHO發布的報告顯示，在世界范圍內，結核病是十大死因之一，也是傳染病中全球第一大死因,且大多數病例發生在亞洲和非洲。2017年，結核病共造成了約130萬艾滋病毒陰性人群和30萬艾滋病毒陽性人群死亡[1]。在2017年新診斷的640萬例結核病中肺外結核(EPTB)新發或復發占14%。一系列數據顯示EPTB在很多地方都有增加的趨勢，但是公共衛生部門并未給予高度重視，這主要是因為EPTB與結核的傳播并不顯著相關。然而，EPTB在結核病的病死率、嚴重并發癥和致殘率較高，是迫切需要解決的一個問題[2-3]。

泌尿系結核是EPTB較為常見的一個類型，也是臨床上一種嚴重的EPTB，臨床上5%～20%的肺結核伴有泌尿系結核[4-5]。泌尿系結核極易誤診，原因在于其癥狀類似于普通的細菌感染且缺乏快速靈敏的實驗室診斷方法，導致患者延誤治療而預后不良。目前，實驗室診斷泌尿系結核的方法主要包括抗酸染色和分枝桿菌培養。抗酸染色既便宜又快速，但缺乏靈敏度和重復性。結核的固體和液體培養雖然具有較高的靈敏度和特異度，但是耗時、耗力，不能滿足快速的臨床要求[6-7]。隨著分子生物學技術的突飛猛進，耐藥結核病相關耐藥基因快速診斷技術的使用日益廣泛。結核分枝桿菌rpob基因和突變檢測技術(Xpert MTB/RIF)系統就是一種全新的快速檢測結核分枝桿菌和其耐藥性的系統，該系統針對結核分枝桿菌的81 bp利福平耐藥核心區間(RRDR)設定引物、探針并進行擴增檢測，根據其是否發生基因突變來檢測樣本中是否含有結核分枝桿菌及其是否對利福平耐藥。該系統是一種全自動一體化半定量巢式實時PCR系統， 可以在2 h內快速對樣本進行核酸提取、純化及濃縮檢測，有報道稱其在肺結核診斷的靈敏度和特異度可高達77.2%和98.8%[8]。但是，GeneXpert尿樣本檢測診斷泌尿系結核的數據有限，其診斷效率需要進一步評估。為對上述泌尿系結核診斷的實驗室方法進行合理評估，筆者對臨床收集的163例疑似泌尿系結核的住院患者尿標本同時進行盲法檢測，以臨床綜合診斷作為泌尿系結核診斷的“金標準”，對抗酸染色鏡檢法、結核桿菌固體培養和Xpert MTB/RIF檢測法進行診斷性能評價，分析它們的診斷價值并比較其一致性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年3月至2018年6月本院住院疑似泌尿系結核患者163例，其中男89例，女74例；年齡29～83歲，平均(57.89±12.98)歲。

1.2儀器與試劑 美國賽沛GeneXpert Dx System及Xpert MTB/RIF 試劑盒，光學顯微鏡(日本Olympus)、抗酸染液(珠海貝索生物技術有限公司)、載玻片、香柏油、CO2孵育箱、羅氏培養基(珠海貝索生物技術有限公司)。

1.3檢測方法

1.3.1尿標本Xpert MTB/RIF檢測 患者無菌留取晨尿40 mL,實驗操作嚴格按照Xpert MTB/RIF 試劑盒說明書進行,即取2 mL尿標本加入4 mL樣本處理液，震蕩混勻后室溫孵育15 min，取2 mL上清液加入檢測試劑盒并加載到GeneXpert Dx System。儀器在大約2 h內自動完成對結核分枝桿菌和RIF耐藥基因的檢測。

1.3.2結核分枝桿菌固體培養 取20 mL尿標本，經3 000×g離心20 min，取沉渣加等量4%NaOH消化液，處理15～20 min后用PBS緩沖液中和(pH=7.4)，取0.1 mL接種羅氏固體培養基,CO2孵育箱35 ℃，8周未見菌落生長者可報告陰性。

1.3.3抗酸染色 取10 mL尿標本，經3 000×g離心20 min，取沉渣涂片干燥抗酸染色，操作步驟按照抗酸染液(珠海貝索生物技術有限公司)說明書進行。鏡檢連續觀察300個油鏡視野，結果按照全國臨床檢驗操作規程報告。

1.3.4泌尿系結核臨床診斷 “金標準” 包括患者臨床癥狀、實驗室檢查及放射影像學特征。無陽性培養證據的可疑患者抗結核治療有效是確診泌尿系結核的唯一指標[9]。

1.4統計學處理 使用SPSS18.0軟件進行數據處理，計數資料以率表示，率的比較采用χ2檢驗。Kappa一致性檢驗評價不同檢測方法的一致性，當Kappa值<0.00，一致性強度極差；0.00～0.20，微弱；0.21～0.40，弱；0.41～0.60，中度；0.61～0.80，高度；0.81～1.00，極強。Kappa值的假設檢驗，μ>1.96,P<0.05可認為2種測定方法結果具有一致性[10]。樣本含量的估算：估計該試驗靈敏度為85%，特異度為80%，設允許誤差Δ=0.10，α=0.05，Zα=1.96(雙側)。則病例組樣本量=1.962×0.90×(1-0.90)/0.102=49；對照組樣本量=1.962×0.80×(1-0.80)/0.102=92，研究樣本多于最少估計例數，具有研究意義。

2 結 果

2.13種方法診斷泌尿系結核的檢測結果及一致性比較 163例疑似泌尿系結核患者中CT或X線片陽性患者46例。163例標本以泌尿系結核臨床診斷為“金標準”檢出泌尿系結核52例(31.90%)，Xpert MTB/RIF、結核桿菌固體培養與抗酸染色的檢出率分別為31.29%(51/163)、24.54%(40/163)和23.93%(39/163)，其檢出率比較差異有統計學意義(P<0.05)。3種實驗室檢測方法與泌尿系結核臨床診斷比較，Xpert MTB/RIF法和結核桿菌固體培養具有極強的一致性，涂片抗酸染色的一致性較弱，結果見表1。

2.23種診斷性試驗的診斷效能評價 3種診斷試驗中，結核桿菌固體培養的特異度最高，Xpert MTB/RIF靈敏度最高，而涂片抗酸染色的靈敏度和特異度均不佳。見表2。

表1 3種方法診斷泌尿系結核的檢測結果

表2 3種診斷性試驗的診斷效能評價(n)

3 討 論

泌尿系結核是EPTB最常見的一個類型，由于該類患者缺乏特異性臨床癥狀，其診斷是醫學上的一大難題。目前泌尿系結核的實驗室診斷方法包括抗酸或熒光染色鏡檢、固體或液體培養。鏡檢方法廉價快速，但是靈敏度低，對人員素質要求高，容易導致漏診；培養方法特異度強，但是通常需要6～8周才能獲得結果，無法滿足臨床快速早期診斷的需求。鑒于傳統診斷方法的固有缺點，急需一種快速、靈敏、特異度高的新型診斷方法。Xpert MTB/RIF檢測技術是WHO在2010年12月推薦用于肺結核診斷的一種新技術，在痰或灌洗液標本的檢測中表現出優異的特性[11]，但是其在泌尿系結核診斷中的價值尚缺乏研究數據。本研究應用一致性檢驗評估抗酸染色鏡檢、結核桿菌固體培養和Xpert MTB/RIF分析法在泌尿系結核診斷中的價值。

本研究以臨床綜合診斷作為泌尿系結核診斷的“金標準”，評估3種診斷試驗的性能，結果顯示，Xpert MTB/RIF法(Kappa值=0.815)和結核桿菌固體培養法(Kappa值=0.819)與臨床診斷具有極強的一致性，而抗酸染色鏡檢(Kappa值=0.319)的一致性較弱。3種方法的檢出率比較差異有統計學意義(χ2=43.09，P<0.05)，Xpert MTB/RIF法(31.29%)檢出率明顯高于抗酸染色鏡檢(23.93%)和結核桿菌固體培養法(24.54%)，但與臨床診斷的“金標準”檢出率(31.90%)基本一致。研究數據表明在檢測尿樣中的結核分支桿菌上，Xpert MTB/RIF的性能優于涂片抗酸染色和結核桿菌固體培養法。上述方法靈敏度的差異主要取決于它們的檢測極限。在這3種方法中，涂片抗酸染色需要5×103～1×104CFU/mL才能產生陽性結果，而Xpert MTB/RIF試驗的檢測極限報告為131 CFU/mL[12-13]。結核分枝桿菌固體培養檢測極限有報道稱為10～100 CFU/mL，但在本研究中其靈敏度低于Xpert MTB/RIF。其原因可能是Xpert MTB/RIF通過檢測死亡細菌細胞中的殘留DNA而得到增強，而培養中標本不能及時處理和使用4%NaOH消化液消化可能導致部分活菌死亡并導致培養的靈敏度下降。涂片抗酸染色檢測極限差，需要較高的細菌濃度才能檢測出陽性。另外一個導致尿涂片抗酸染色靈敏度較差的原因是尿液的非黏性性質降低標本中抗酸桿菌在玻片的穩固性，從而降低尿樣中涂片的陽性率[14]。涂片抗酸染色特異度較低主要由于非典型分支桿菌的存在導致“假陽性”結果和染色不佳時抗酸顆粒影響閱片。盡管有這些缺點，涂片抗酸染色對于EPTB，特別是在結核病高負擔地區仍然是一種廉價、快速有效益的篩查方法。

3種結核分支桿菌診斷方法在泌尿系結核診斷中結核桿菌固體培養法特異度最強，是泌尿系結核確診的一個重要依據，并且可以為治療提供藥物靈敏度試驗，但是培養時間長限制了其廣泛應用。尿沉渣抗酸染色鏡檢價格低廉，實驗室要求低，適合結核高發區泌尿系結核的快速篩查。由于其靈敏度和特異度均較差，需要多次重復檢查。對于尿液非黏性特性提示需要改進技術，如在沉渣中加入無菌血清，從而提高結核分支桿菌的黏附性，以提高鏡檢的陽性率。Xpert MTB/RIF 檢測技術不但具有較高的靈敏度，而且具有很高的特異度，可在2 h內快速對尿液樣本中的結核分支桿菌進行檢測，是一種快速高效的診斷泌尿系結核的方法，但是昂貴的費用對于發展中國家的患者是一種沉重的負擔[15]。Xpert MTB/RIF技術在尿液標本結核分支桿菌檢測的靈敏度低于痰標本，其原因與泌尿系結核患者排菌量較低并且呈間斷性有關，提示可以通過留取更多標本進行集菌后檢測來提高其靈敏度。

4 結 論

3種實驗室檢測方法與臨床診斷“金標準”法比較，經Kappa檢驗，Xpert MTB/RIF和固體培養法具有很高的一致性。研究數據表明GeneXpert在檢測性能上優于涂片抗酸染色和結核桿菌固體培養，該方法可以為臨床早期、快速診斷泌尿系結核提供實驗室依據。