SALL4基因表達與急性髓細胞白血病細胞系KG1a耐藥相關性研究

郭 野

(中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科，北京 100730)

化療能使大部分急性髓細胞白血病患者的病情獲得緩解，但是仍有相當一部分患者最終會復發。白血病細胞產生耐藥性是導致疾病復發、治療失敗的主要原因之一[1-2]。在白血病細胞中存在0.1%～1.0%具有自我更新能力的白血病干細胞,它保留了干細胞的主要特征，其具有ATP相關轉運體對藥物、毒素、凋亡刺等耐受，可以逃避化療藥物的作用，這可能是白血病復發和耐藥的原因[3-4]。SALL4基因過表達具有白血病致癌作用，它通過激活造血干細胞自我更新的重要通路Wnt/β-Catennin通路的活性，促進白血病干細胞不斷增殖，導致白血病的發生[5-6]。但SALL4基因與白血病細胞耐藥是否有關，還不得而知。本研究采用RNA干擾技術通過抑制白血病細胞KG1A中SALL4基因的表達，探討SALL4基因表達改變時，其對化療藥物的耐受情況，以探尋SALL4基因與急性髓細胞白血病耐藥的相關性。

1 材料與方法

1.1材料 AML-細胞系KG1a購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。由GeneBank提供SALL4基因的引物序列，參考基因為β-actin，設計熒光定量PCR方法所用引物，并由北京奧科生物工程有限公司合成。所用基因和引物序列相關信息見表1。

表1 引物序列和片段大小

1.2試劑與儀器 成品shRNA-pRS質粒載體干擾SALL4基因表達系統為美國 Origene公司產品，Opti-MEMⅠReduced 血清、PLUS Reagent及DNA-Lipofectamin LTX購自美國 invitrogen公司，RNA提取試劑盒購自美國QIAGEN公司，逆轉錄PCR試劑盒購自加拿大New England BioLabs公司，熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex Taq購自大連寶生物工程大連有限公司，RPMI 1640培養液購自美國GIBCO公司，MTS細胞增殖檢測試劑盒購自美國Promega公司。阿霉素、柔紅霉素購自北京中碩科技有限公司。PCR熱循環儀、電泳儀、凝膠成像儀購自美國BIO-RAD公司，Light Cycler熒光定量PCR擴增儀購自瑞士Roche公司，酶標儀購自芬蘭熱電公司，光學顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養 急性髓系白血病細胞系KG1a以含10% FBS的RPMI 1640培養液于37 ℃ 5% CO2飽和濕度條件下培養，每2～3天進行換液。

1.3.2KG1A細胞轉染 按照文獻[7]轉染KG1A細胞，設空白組(blank)、轉染對照組(control組)，轉染組(test)于37 ℃ 5% CO2飽和濕度條件下培養test組轉染SALL4-shRNA-pRS-1質粒載體，control組轉染空shRNA-pRS1質粒載體。

1.3.3逆轉錄PCR及熒光定量PCR檢測基因表達 轉染48 h后收集各組KG1A細胞1×105個，進行逆轉錄PCR及熒光定量PCR。熒光定量PCR擴增反應條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，57 ℃30 s，72 ℃ 20 s，78 ℃ 1 min，共40個循環。以β-actin為內參基因， SYBRGreen熒光染料法和ΔCt進行基因表達定量分析[7]。

1.3.4體外藥敏試驗 各組分別接種到含不同濃度化療藥物的新鮮10% FBS RPMI 1640培養液的96孔板中。其中阿霉素和柔紅霉素均配成4個濃度梯度，分別為0.0、0.1、0.5、1.0 μg/mL。嚴格按照試劑盒操作要求在反應24 h后,將細胞增殖劑MTS-1添加到每個孔中。在450 nm處酶標儀讀取結果。上述實驗重復測定5次。

2 結 果

2.1RNAi抑制白血病細胞SALL4基因表達的分析 熒光定量PCR結果顯示，test組和control組的SALL4基因表達水平為blank組的(30.0±4.9)%、和(102.0±6.5)%。 test組SALL4基因表達水平顯著低于blank組(t=9.1，P<0.05)；control組SALL4基因表達水平與blank組相比差異無統計學意義(t=1.1,P>0.05)。

2.2體外藥敏試驗結果分析 各組細胞在不同濃度的阿霉素作用24 h后，細胞相對增殖率呈規律性變化，見表2。在阿霉素作用下，SALL4基因抑制表達后，細胞增殖率較其正常表達時顯著下降， 而這種趨勢在不同濃度的阿霉素作用時均有體現。說明當SALL4基因抑制表達時，白血病細胞的耐藥性會減弱。但隨著阿霉素濃度的增加這種減弱趨勢會降低，見圖1A。當使用柔紅霉素進行實驗時也得到了相似的發現，見表3，在柔紅霉素作用下，SALL4基因抑制表達后，細胞增殖率較其正常表達時顯著下降。 在各個濃度柔紅霉素作用下，SALL4抑制表達時細胞增殖率較其正常表達時均會顯著下降，見圖1B。

表2 不同濃度的阿霉素處理后細胞相對增殖率的改變

注:與control組比較,*P<0.05

表3 不同濃度的柔紅霉素處理后細胞相對增殖率的改變(%)

注:與control組比較,*P<0.05；與blank組比較,#P<0.05

注：A表示不同濃度阿霉素處理后；B表示不同濃度柔紅霉素處理后

圖1 SALL4不同表達水平下細胞相對增殖率的改變折線圖

3 討 論

SALL4是一種在鼠科胚胎細胞中新發現的多功能干細胞因子。它在維持肝臟星狀細胞的多能性方面具有重要的作用，并與造血系統發育和血液惡性腫瘤,特別是髓系白血病的發生具有相關性。以往研究表明它通過調節Wnt/β-catenin信號通路而導致白血病干細胞的異常增殖[8-9]。白血病干細胞不但是血液腫瘤發生的重要因素，而且與白血病耐藥具有密切關系。SALL4基因作為白血病干細胞的重要調節因子,其與白血病耐藥的關系還鮮有報道。本研究通過RNA干擾技術，抑制急性髓細胞白血病細胞系KG1A中SALL4基因的表達，然后與常用的化療藥物阿霉素和柔紅霉素處理后，反向探尋SALL4基因不同表達水平下細胞相對增殖率的變化。

阿霉素為廣譜抗腫瘤藥，對機體可產生廣泛的生物化學效應，具有強烈的細胞毒性作用。其作用機理主要是該品嵌入DNA而抑制核酸的合成。臨床上用于治療急性淋巴細胞白血病、急性粒細胞性白血病等[10-11]。本實驗對不同處理組的KG1A細胞進行不同濃度的阿霉素處理，SALL4基因抑制表達時細胞的相對增殖率要顯著低于SALL4基因正常表達時的水平。阿霉素的治療效果與SALL4基因表達量相關，而阿霉素的使用濃度逐漸增高時這種趨勢并未發生改變。柔紅霉素為第1代蒽環類抗腫瘤抗菌藥物，作為一種周期非特異性化療藥，其主要用于治療各種類型的急性白血病(包括粒細胞性、淋巴細胞性、單核細胞性及粒-單核細胞性)、紅白血病、慢性粒細胞性白血病、惡性淋巴瘤等[12-13]。使用柔紅霉素來重復上述實驗時，得到了相似的實驗結果，柔紅霉素的治療效果與SALL4基因表達量同樣具有相關性，SALL4基因表達量越高，柔紅霉素的治療效果越差。而隨著柔紅霉素使用濃度的增高，白血病細胞相對增殖率逐漸下降，但是藥物濃度的改變并不影響SALL4抑制表達組的治療效果均優于SALL4高表達組這一事實。上述體外實驗表明，SALL4基因與急性白血病細胞產生抗藥性密切相關[14]。而其耐藥機制也是源于其SP細胞的特性。SP細胞具備非常強大的細胞膜泵功能以避免有害物質的入侵。Hoechst 33342可結合至DNA的A-T富集區域進入活細胞內，但是它也會被ATP-Binding Cassette(ABC)轉運子排出細胞外，其這一特性，可以通過流式細胞儀把SP細胞和非SP細胞分開。化療藥物可能也可以通過高表達ABC轉運家族成員ABCG2后，外排藥物而導致腫瘤細胞發生耐藥。多個血液腫瘤細胞的SP細胞SALL4基因的表達量均高于在非SP細胞中SALL4基因的表達。另外， SALL4基因抑制表達前后SP細胞的比例也會減低。SALL4與白血病發生耐藥的機制可能源于SP細胞的外排功能而發揮作用[15]。

4 結 論

終上所述，SALL4基因的表達是急性髓細胞白血病產生耐藥的正性調節因素，這一發現不僅有助于對急性髓細胞白血病發生耐藥機制的認識，而且為以后的特異性靶向治療提供了理論依據。其促進白血病發生耐藥的具體機制可能是通過影響側群細胞的外排機制而起作用，但更深入的機制還有待進一步研究。