徐州地區0～8歲兒童尿液HCMV-DNA結果分析

宋子威，張 微，劉志堅，李 穎，李世寶,3△

(1.徐州醫科大學附屬醫院檢驗科,江蘇徐州 221002；2.徐州市泉山社區衛生服務中心檢驗科,江蘇徐州 221002；3.徐州醫科大學醫學技術學院,江蘇徐州 221002)

人巨細胞病毒(HCMV)屬于β皰疹病毒亞科，具有嚴格的種屬特異性和潛伏-活化的生物學特性，屬于人類普遍易感的常見病原體之一。原發感染以嬰幼兒時期為主，大多為無臨床癥狀的潛伏感染[1]。HCMV是引起先天性及圍生期感染的重要病原體，可通過胎盤、產道、母乳或密切接觸直接傳播給嬰兒，導致死胎、流產、早產、生長發育遲緩、畸形及遲發的智力低下、聽力損害等不良妊娠結局[2-3]，嚴重影響新生兒的健康。在器官移植、惡性腫瘤、采用免疫抑制劑治療等免疫功能低下者中，HCMV感染甚至可以引起患者死亡[4]。為了解徐州地區兒童HCMV的感染情況，現對2017年1月至2018年12月檢測結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2018年12來徐州醫科大學附屬醫院就診的疑似HCMV感染患兒1 095例為研究對象。其中男676例，女419例，男女比例為1.61∶1；年齡0 d至8歲，中位年齡4個月。對患兒尿液及其母乳分別進行HCMV-DNA檢測，尿液1 095份，母乳108份，尿液和母乳配對樣本105份。

1.2儀器與試劑 ABI7500實時熒光定量PCR(qPCR)儀、Eppendorf高速冷凍離心機、Eppendorf金屬浴恒溫器、Eppendorf漩渦振蕩儀；HCMV-DNA qPCR試劑盒，購自上海之江生物科技股份有限公司。

1.3方法

1.3.1標本采集與處理 尿液樣本：無菌試管留取患兒1 d內3次混合尿液5.0 mL，充分混勻后吸取尿液1.0 mL于1.5 mL的無菌離心管中，12 000 r/min 離心10 min，棄上清；沉淀加無菌生理鹽水1.0 mL混勻，15 000 r/min 離心5 min，棄上清；沉淀加入50 μL核酸抽提液漩渦混勻，100 ℃干浴10 min，使病毒顆粒完全裂解，然后13 000 r/min離心10 min，保留上清備用。乳汁樣本：清潔乳頭后用自我擠壓法擠出約5 mL乳汁入無菌試管中，3 000 r/min離心5 min，吸取脂質下層乳清1.0 mL于1.5 mL的無菌離心管中，12 000 r/min離心10 min，棄上清；沉淀加入50 μL核酸抽提液漩渦混勻，100 ℃干浴10 min，使病毒顆粒完全裂解，然后13 000 r/min離心10 min，保留上清備用。

1.3.2qPCR擴增 取4 μL DNA模板加入定量PCR反應液中，放入ABI 7500 qPCR儀進行擴增。擴增條件為37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，1個循環；93 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min，40個循環；單點熒光采集在60 ℃。每次試驗設置陰性、陽性對照。

1.3.3結果判讀 PCR反應結束后，電腦根據標準曲線自動分析計算檢測結果。HCMV-DNA載量以基因拷貝/毫升表示，HCMV-DNA>500拷貝/毫升為陽性。

1.4統計學處理 數據采用SPSS17.0軟件進行統計分析，計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同性別患兒尿液HCMV-DNA檢測結果 1 095例患兒中陽性348例(31.78%)；陰性747例(68.22%)。其中男童陽性219例，陽性率32.40%；女童陽性129例，陽性率30.79%，男女陽性率比較差異無統計學意義(χ2=0.308 8，P=0.578 4)。

2.2不同年齡段患兒尿液HCMV-DNA檢測結果 169例不足1月齡患兒中僅1例陽性；1月齡之后陽性率逐漸升高，在5～6月齡升至最高，為55.74%，1～2月齡、3～4月齡、5～6月齡3個年齡段陽性率兩兩比較差異均有統計學意義(χ2=15.429 2、59.516 6、14.448 5，均P<0.001)；7～12月齡陽性率與5～6月齡比較變化不大(χ2= 0.076 8，P=0.781 7)；隨著年齡增長陽性率逐漸降至4.88%(χ2=19.709 6，P<0.001)。見表1。

表1 0～8歲患兒各年齡段尿液HCMV-DNA檢測結果

2.3不同季節患兒尿液HCMV-DNA檢測結果 春季(3～5月份)、夏季(6～8月份)、秋季(9～11月份)、冬季(12～次年2月份)陽性率分別為31.77%、31.20%、29.34%、33.16%，差異無統計學意義(χ2<0.001，P>0.05)。見表2。

表2 0～8歲患兒各季節尿液HCMV-DNA檢測結果

2.4不同居住地患兒尿液HCMV-DNA檢測結果 576例來自農村的患兒陽性216例，陽性率為37.50%；519例來自城鎮的患兒陽性132例，陽性率為25.43%。兩組陽性率差異有統計學意義(χ2=18.334 3，P<0.001)。

2.5108例母乳HCMV-DNA檢測結果 108例母乳樣本中HCMV-DNA陽性45例，陽性率為41.67%。在105例母子配對樣本檢測中，患兒尿液HCMV-DNA陽性的57例中母乳陽性40例，占70.16%；患兒尿液HCMV-DNA陰性的48例中母乳陽性4例，占8.33%，差異有統計學意義(χ2=40.934 7，P<0.001)。見表3。

表3 105例母子配對樣本HCMV-DNA檢測結果(n)

2.6尿液HCMV-DNA陽性患兒疾病分布 患兒HCMV感染的相關疾病以呼吸道感染為主，其中支氣管炎/肺炎所占比例最大(59.20%，206/348)，其次為急性上呼吸道感染、肝炎綜合征等。見表4。

表4 尿液HCMV-DNA陽性的相關疾病所占比例[n(%)]

3 討 論

血清特異性抗體檢測、尿液HCMV-DNA檢測和血液HCMV-DNA檢測是目前診斷HCMV感染的常用方法。臨床上，IgG陽性多提示既往感染。由于可以通過胎盤，新生兒血清HCMV-IgG水平常反映母體抗體情況。HCMV-IgM抗體雖然能間接證實體內HCMV的存在，但是不可避免存在檢測窗口期，并且患兒免疫功能低下，也會影響抗體生成的敏感性，導致假陰性的結果。在急性感染期，嬰幼兒的泌尿道上皮細胞是HCMV最易侵襲的場所，此時病毒排量大，在尿液標本中穩定性好，而且與血清抗體相比，尿液HCMV-DNA檢測快速、無創，易被患兒和家長接受，能作為判斷藥物療效的定量指標。血液HCMV-DNA檢測雖然和尿液HCMV-DNA檢測一樣，高濃度結果能提示患者體內HCMV處于活躍期并大量復制，但是靈敏度不如尿液HCMV-DNA檢測[5-7]，而且屬于有創檢查，容易受到患兒和家屬的抵觸。由于腎小管排毒具有間歇性，大量飲水時尿液被稀釋，檢測結果陰性不能完全排除HCMV感染，臨床上除了留取患兒多次混合尿液進行檢測，聯合血液HCMV-DNA檢測是對患兒診斷HCMV感染的有效補充。

HCMV感染呈全球性分布。因社會經濟發展水平、衛生條件和生活習慣的不同，不同國家甚至同一國家不同地區之間感染率也存在差異。發達國家兒童血清抗體陽性率約為50.41%；上海地區1～3歲兒童血清抗體陽性率為60.37%；南京地區0～8歲兒童血清抗體陽性率為82.40%；華中地區住院兒童血清抗體陽性率為88.11%[8-11]。本次調查共統計1 095例患兒，尿液HCMV-DNA陽性率約為32.00%，高于長沙地區健康嬰幼兒18.49%的陽性率[12]，亦高于東莞地區患兒10.07%的陽性率[13]。此外，核酸陽性率遠低于抗體陽性率，表明HCMV進入人體后大多以排毒量小于檢測下線、僅產生特異性免疫應答而不產生臨床癥狀的隱性感染和潛伏感染為主。HCMV感染與性別無關，無季節性，全年散發，冬季多密集，這與HCMV的感染特性一致。來自農村的患兒HCMV-DNA陽性率高于來自城鎮的患兒，這提示HCMV感染與家庭條件和社會環境等密切相關；此外，生活方式的不斷融合和統一使得城鄉兒童的HCMV感染有逐漸接近的趨勢。

HCMV感染在各年齡段均可發生，隨著年齡增長，陽性率先升高后降低，且與新生兒期(0～28 d)相比，嬰兒期(28 d至1歲)和幼兒期(1～3歲)陽性率明顯較高。原因可能如下：經胎盤和母乳從母體獲得高滴度的HCMV-IgG抗體，使得患兒感染HCMV后多表現為不產生感染性病毒的潛伏感染；隨著患兒與外界環境的不斷接觸，HCMV在HCMV-IgG抗體陽性母親的乳腺細胞中再激活及母源性抗體的消耗殆盡，導致發生活動性感染[14]；最后，隨著患兒自主免疫的不斷完善、垂直傳播來源的不斷清除及哺乳期的結束，活動性感染再次轉變為潛伏感染。此外，本調查還提示該地區兒童HCMV感染在5～12月齡達到最高峰，這與吳美玲等[10]的研究發現不一致，可能由檢測方法、地域差異以及抽樣誤差引起。

母乳喂養因優點眾多一直受到大力提倡，然而近年來研究卻發現母乳喂養是嬰幼兒HCMV感染的重要途徑之一，有調查稱乳汁排毒率為13%～70%[15-16]。本調查共統計108例乳汁樣本，HCMV陽性率為41.67%，低于國內報道的結果43.80%～81.63%，不排除與樣本量少有關。尿檢陽性患兒母乳的陽性率遠大于尿檢陰性患兒母乳的陽性率，高度提示母乳可能是患兒感染HCMV的重要途徑之一。

HCMV感染往往缺乏臨床特異性，但仍有部分感染患兒伴有不同程度的肺炎、肝脾腫大、血小板減少性紫癜等，黃疸亦可為其唯一表現形式。本調查結果顯示，HCMV感染患兒以呼吸道感染居多，可能是因為嬰幼兒呼吸系統發育不成熟，對病原體抵抗力差，不能充分咳嗽與咳痰；其次是肝炎綜合征，提示肝臟是HCMV的重要靶器官之一。HCMV肝炎患兒肝臟腫大程度比乙型肝炎病毒等嗜肝病毒所致的肝臟腫大明顯，病情輕重不一，大多數治療后預后良好，少數重癥可發展為肝硬化、腹水。此外，HCMV感染還伴有不同程度的腸炎、血小板減少等，更有部分患兒多個系統同時受到影響。由于胃腸道抵抗力差、喂養不當，嬰幼兒容易出現小兒腸炎。最新資料表明，HCMV感染與血小板減少、神經系統發育落后密切相關[17]，而患兒粒細胞減少很有可能是抗HCMV藥物所導致的骨髓抑制，但這種不良反應通常可以逆轉，必要時給予升白細胞等措施能達到良好的治療效果。上述研究結果提示兒科醫生在臨床診療中對HCMV感染要有足夠的重視，及時進行檢測，及早進行干預。

4 結 論

徐州地區兒童HCMV感染率較高，感染高峰集中在5～12月齡，需要加強母嬰HCMV感染的防控工作。嬰幼兒感染HCMV可引起多系統受累及一系列臨床表現，當患兒出現原因尚不明確的上述癥狀時，及時進行尿液HCMV-DNA檢測對早期診斷具有重要意義。