腎移植術后急性腎損傷患者血清氨基酸水平變化及相關性分析

李志琪，王清華

(1.陸軍軍醫大學第二附屬醫院藥學部，重慶 400037;2.瀘州市中醫醫院藥劑科，四川瀘州 646000)

氨基酸是人體生命活動中至關重要的一類代謝物質基礎，具有廣泛的生物學功能。腎臟是新陳代謝最為旺盛的器官之一，也是氨基酸代謝的重要組織器官，對體內氨基酸代謝有著重要影響。病理條件下，腎臟代謝功能失調均會引起氨基酸代謝發生紊亂，導致血液中氨基酸水平變化，如不同階段慢性腎臟疾病[1-5]、血液透析[1,6]、腎移植排斥[7]、急性腎損傷[8-10]等。因此，檢測腎移植術后急性腎損傷患者血清需氨基酸水平有著重要的意義。本研究旨在探討腎移植術后和腎移植術后AKI患者精氨酸(Arg)、對稱二甲基精氨酸(SDMA)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和犬尿氨酸(Kyn)等血清氨基酸的水平及變化情況，以及氨基酸與腎小球濾過率(eGFR)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、尿酸(UA)、他克莫司血藥水平(FK506 Cmin)和口服他克莫司量與他克莫司血藥水平比值(Oral FK506/FK506 Cmin)等腎功能指標的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 研究對象為2016年12月至2017年11月在陸軍軍醫大學第二附屬醫院住院的腎移植患者，其中男36例，女29例，平均年齡(37.40±10.71)歲。另選擇健康志愿者79例為對照(CHV組)，其中男7例，女7例，平均年齡(31.29±7.83)歲。所有腎移植患者和健康志愿者均進行詳細的檢查，包括所有的臨床生化檢測指標、體征、血常規、血型、糞常規、尿常規、儀器檢查心電圖、腹部彩超、胸腹部CT檢查、病史資料、藥物不良反應等。依據改善全球腎臟病預后組織(KDIGO)定義急性腎損傷診斷標準將腎移植患者分為腎移植術后使用FK506表現正常者(ART組)37例，腎移植術后使用FK506發生急性腎損傷者(AKI組)28例。

腎移植患者口服免疫抑制的方案為：FK506、強的松片、賽可平片或米芙的三聯免疫用藥。納入標準：有SCr、BUN、UA和FK506血藥水平監測數據等的患者，心、肺、肝等功能正常者；醫囑良好患者，無糖尿病等并發癥的患者；無感染患者(HIV抗體陰性、梅毒試驗陰性)；腎功能愈合表現為正常的患者。排除標準：有使用過其他免疫抑制劑如環孢素的患者；肝移植、其他器官移植和多器官移植者；有癌癥者；資料不完整，年齡<18或>60歲者；妊娠婦女；甲狀腺功能亢進或減退者；抗真菌藥物及其他引起的腎毒性患者；腎移植感染的患者；腎移植腎炎患者；研究中出現排斥的患者；個人原因放棄者(死亡者)。所有研究對象于上午8：00-9：00點抽取空腹靜脈血5 mL置于乙二胺四乙酸三鉀采血管內，震蕩搖勻，靜止30 min后取上層血清置于1.5 mL EP管中，保存于-20 ℃冰箱待測。

1.2血清氨基酸測定 血清氨基酸水平采用前期建立的超高效液相色譜-質譜聯用(UHPLC-MS/MS)法[8]進行檢測。取血清樣本100 μL，置于1.5 mL EP管內，加入300 μL蛋白沉淀劑乙腈(含0.2%甲酸和0.4 μg/mL內標物)，靜止3 min，渦旋2 min，13 400×g高速離心15 min，取上層清液，轉至進樣小瓶進行分析。

色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(3 mm×150 mm，5 μm)，流動相系統。A相為甲醇；B相為水相(包含0.20%甲酸和0.02%七氟丁酸)，柱溫為50 ℃，進樣量2 μL，采用ESI源正離子多反應監測模式(MRM)進行質譜分析。質譜參數優化后如下：霧化氣壓力345 kPa；干燥氣溫度325 ℃；流速10 L/min；鞘氣溫度350 ℃，毛細管電壓5 kV。

2 結 果

2.1腎功能臨床生化指標結果 與CHV組、ART組比較，AKI組患者eGFR值明顯下降，SCr、BUN、UA及Oral FK506/FK506 Cmin值明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2血清氨基酸水平結果 與CHV組、ART組比較，AKI組患者血清Arg、SDMA、Phe和Kyn水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)；血清Trp水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；血清Tyr水平無明顯降低，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 腎功能臨床生化指標分析結果

注：*表示t檢驗，+表示Mann-WhitneyU檢驗；分別與CHV組和ART組兩兩比較，*和+表示P<0.05，**和++表示P<0.01

2.3腎損傷患者血清氨基酸水平與臨床生化指標相關性分析 對28例腎移植術后使用FK506發生急性腎損傷患者的血清Arg、SDMA、Phe、Trp、Tyr和Kyn水平與反映腎功能的常規臨床生化指標(eGFR、BUN、SCr、UA、FK506 Cmin和Oral FK506/FK506 Cmin)進行相關性分析,結果表明,SDMA與eGFR、FK506 Cmin、Oral FK506/FK506 Cmin呈負相關(P=0.005、0.026、0.001)，與BUN、SCr呈正相關(P=0.002、0.001)；Trp與eGFR、FK506 Cmin呈正相關(P=0.003、0.008)，與BUN、SCr呈負相關(P=0.006、0.002)；Arg與UA呈負相關(P=0.005)。見表3。

表2 血清氨基酸水平結果

注：*，△表示t檢驗；+，#表示Mann-WhitneyU檢驗。*和+表示ART組、AKI組與CHV組比較，P<0.05；△和#表示AKI組與ART組比較，P<0.05；**和++表示ART組、AKI組與CHV組比較，P<0.01；△△和##表示AKI組與ART組比較，P<0.01

表3 氨基酸水平及比值與臨床生化指標的相關性分析

注：**表示P<0.01，*表示P<0.05

3 討 論

腎臟在人體新陳代謝過程，扮演著一個重要的角色，即參與合成和降解生物活性代謝物質，如氨基酸、脂肪酸、糖類等。腎功能受損，如急性腎損傷、終末期腎病等則影響著人體正常生理機能。尿素、肌酸酐都是尿素循環中的直接或間接產物，是體內氨基酸及蛋白質的代謝廢物，通過腎臟代謝和排泄。

SDMA作為Arg的同系物，參與人體內尿素循環，其水平變化受腎臟功能和結構影響，也影響腎臟的生理功能。研究證明，在細胞內S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體的條件下，含有Arg殘基的蛋白質經過蛋白精氨酸甲基轉移酶類Ⅱ的作用發生甲基化，甲基化的蛋白質再經過水解產生SDMA，但SDMA主要代謝途徑是經過腎臟排泄[11]。SDMA通過抑制堿性氨基酸轉運載體而間接作用于一氧化氮合酶(NOS)，從而間接抑制著Arg[11-12]。急性腎損傷患者，排泄尿量急劇銳減，使得SDMA不能隨尿液排泄，導致體液循環中SDMA水平增加，間接引起NO減少，造成心血管系統、神經系統炎癥和免疫系統等生理機理紊亂。FLECK等[13]回顧分析發現，腎移植術后患者的SDMA與SCr存在著極強的線性相關(R2=0.94，P<0.001)。結合本文研究進一步證明，血清SDMA水平與腎臟病理損傷程度(SCr、eGFR、BUN等)的關系甚為密切。

體內Trp主要代謝途徑是通過吲哚胺-2，3-雙加氧酶(IDO)代謝生成Kyn，再經過一系列反應，最終生成犬尿酸、黃尿酸和CO2等經腎臟排出。IDO是肝外組織唯一可催化Trp分解產生Kyn的限速亞鐵血紅素酶[14]。在正常生理狀態下，IDO一般處于低水平表達，而當機體處于疾病狀態時，體內產生的因某些因子如干擾素γ、白細胞介素-10等促使并加速IDO表達，加速生成Kyn的代謝途徑，導致Trp匱乏[15]。SCHEFOLD等[16]在評估慢性腎臟病患者的腎功能狀態時，隨著慢性腎臟疾病等級的加重，血清中的IDO活性表達增強，導致Kyn水平呈上升趨勢，而Trp水平逐漸下降。同時，本研究也證明，使用FK506導致的急性腎損傷組Trp水平明顯比腎移植術后使用FK506表現正常者組和健康志愿者減少，而Kyn水平恰好相反；并且血清Trp與腎臟病理損傷程度(SCr、eGFR、BUN等)的相關性也比較密切。

4 結 論

機體內某些氨基酸，如SDMA、Trp和Kyn的代謝變化極有可能與腎移植術后使用免疫抑制(FK506等)引起的藥源性腎損傷過程及病理損傷程度呈密切相關性。因此，血清氨基酸的水平測定可以反映患者氨基酸的代謝變化及疾病的進展與愈后情況，對于藥源性腎損傷的早期干預有一定的指導作用，并且還可進一步彌補臨床上現有生化診斷指標的缺陷與不足。但本研究為回顧性分析，選取的樣本量較小，SDMA、Trp和Kyn的水平測定價值還需要大規模的、深層次的和前瞻性試驗數據支持。