日本積水乳膠凝集法KL-6試劑盒的性能評價

岳道遠 ，鄧玲艷，王 旭，潘瑩瑩，胡衛紅

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科，湖北武漢 430030)

血清人唾液酸化糖鏈抗原6(KL-6)是KOHNO等[1]發現并命名的高分子量糖蛋白，屬于分類為Cluster9的上皮性黏蛋白1(MUC1)蛋白。KL-6主要由增殖的、受激發的或受損的Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌，對判斷Ⅱ型肺泡上皮細胞的功能具有特異性。在肺泡損傷的初期，KL-6表達明顯增加，并從肺部滲到血液中從而使血清中KL-6水平也升高[2]，并且這種升高與組織的纖維化損傷程度呈正相關[3]。近年有研究報道血清KL-6高水平表達可能與間質性肺疾病[4]、急性肺損傷[5]、病毒性肺炎[6]、藥物相關性間質性肺炎[7]、腫瘤等疾病相關聯，其作用可能是促進成纖維細胞增殖和遷移，從而影響纖維化的發生和發展[8]。有研究發現，血液中KL-6水平能夠敏感地反映肺泡上皮和間質的損傷程度，在日本已經成功作為過敏性肺炎、結節病和放射性肺炎等疾病的特異性診斷標志物用于臨床診斷[9-11]。2006年中國原衛生部頒布的《醫療機構臨床實驗室管理辦法》中明確要求，臨床實驗室在某一檢測項目正式用來檢測患者標本、發出檢驗報告前，實驗室需對其相關方法學分析性能進行評價，現根據文獻、國內外標準和指南的要求評價積水公司的KL-6定量檢測試劑盒在本實驗室羅氏MODULAR P800全自動生化分析系統上的性能，報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 瑞士羅氏公司生產的MODULAR P800全自動生化分析儀；日本積水公司生產的血清KL-6定量檢測試劑盒(批號:909RLM)及配套校準品(批號:917JYK，918HYK)、質控品(批號:803MGO)。日本希森美康公司生產的干擾物A-PLUS(批號:ZS6003)。

1.2標本來源 2016年1—10月本院門診、住院患者生化常規檢測后將剩余血清標本，分裝于凍存管保存在-80 ℃冰箱，檢測前進行復溫。

1.3方法

1.3.1儀器準備 實驗前按廠商要求對MODULAR P800進行維護保養和功能校準，室內質控合格，以確保儀器各項性能合格，操作人員均規范培訓，以熟練掌握儀器的操作和了解整個實驗方案。

1.3.2精密度及正確度評價 參照臨床實驗室標準化協會(CLSI)EP5-A2的標準[12]，選取低值和高值2個水平質控品，批號均為803MGO，標示水平分別為150 U/mL和1 130 U/mL，1 d內連續測定20次，計算日內不精密度；然后每天測定1次，連續檢測20 d，計算日間不精密度。參照CLSI EP15-A2標準[13]和國內畢波等[14]的方案，復測不同批號校準品，計算允許偏差來進行正確度驗證，允許偏差標準以目前實驗室所能達到的技術性能來制訂[15]，即<10%為合格。

1.3.3分析測量范圍及稀釋回收試驗評價 參照CLSI EP6-A2標準[16]，選取線性范圍兩端低水平(L)、高水平(H)2個標本各1份，然后按不同份數比進行混合配比：5份L+0份H、4份L+1份H、3份L+2份H、2份L+3份H、1份L+4份H、5份H+0份L,配成6個水平的系列標本,每份標本測定2次，計算線性回歸方程和相關系數(r)，r>0.990表明分析測量范圍驗證合格。選取3份高值標本，其中1份水平在5 000 U/mL左右(接近分析測量范圍上限)，將樣本通過儀器自動稀釋3倍后，檢測2次取均值，將均值乘以稀釋倍數，如回收率在90%～110%，則稀釋回收試驗驗證通過。

1.3.4檢出能力評價 根據CLSI EP17-A2指南[17]的要求，選取接近定量檢出限(LoQ)水平的3個低值標本，用標記水平為0的校準品對標本進行稀釋至LoQ附近，然后每天重復測量5次，連續檢測4 d，總計20個有效數據，計算不精密度，若<20%(廠商標準)，則驗證通過。

1.3.5生物參考區間驗證 參照WS/T402—2012《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》的要求[18]，選擇74例健康體檢成年人，入選標準：影像學無肺部病變，血糖、糖化血紅蛋白、同型半胱氨酸、胱抑素-C等生化指標檢測結果正常；若<5%(95%CI)的結果超出廠商提供的參考區間，則驗證通過。

1.3.6分析干擾能力的評價 依據CLSI EP7-A2指南[19]的建議，采用添加外源性干擾物的方式來進行KL-6抗干擾性能評估。購買日本Sysmex公司A-PLUS系列干擾物，標示水平分別為游離膽紅素200 mg/dL，結合膽紅素200 mg/dL，溶血血紅蛋白5 000 mg/dL，乳糜微粒2 000 FTU的干擾物和對應的空白液。將溶解好的干擾物和空白液分別與混合血漿按比例配置成一定水平梯度的檢測物，以原混合血漿作為空白對照，測定各檢驗項目，判斷其受干擾程度。

2 結 果

2.1不精密度評價結果 2個水平的積水KL-6質控品的日內不精密度分別為3.15%和0.98%，日間不精密度分別為4.99%和1.66%，均低于廠商提供的不精密度標準，見表1。

表1 積水KL-6 2個水平質控品在MODULAR P800上檢測的不精密度結果

2.2正確度評價結果 使用批號為917JYK(EXP:2018年10月)的校準品校準檢測系統后，對另一批號為918HYK (EXP:2019年1月)的校準品進行檢測，重復檢測3次計算均值與偏差；依據當前技術水平，以廠商聲明允許偏差(<20%)的1/2作為實驗室允許偏差；4個不同水平校準品檢測均值與標示值的偏差在-0.22%～1.53%，均低于本實驗室規定的允許偏差,見表2。

表2 積水KL-6校準品在MODULAR P800上檢測的正確度評價結果

2.3分析測量范圍評價結果 以自配標本的實測均值為Y，預期值為X，得出線性回歸方程為Y=0.982 5X-44.233 0，Pearson相關系數r=0.998 3，即r>0.990，直線回歸方程斜率在0.97～1.03，且P<0.05，數據呈線性關系。故本實驗驗證的KL-6分析測量范圍為50.1～4 935.5 U/mL，與試劑廠商提供的線性范圍(50～5 000 U/mL)接近，驗證合格，見表3。

表3 積水KL-6試劑在MODULAR P800上檢測的分析測量范圍

2.4稀釋倍數驗證及臨床可報告范圍評價 將3份高值標本用儀器3倍自動稀釋后，重復檢測2次取均值；原倍標本重復檢測2次后取均值；再計算回收率，以回收率在90%～110%判定為合格。本次3份標本的稀釋檢測回收率均合格，見表4。臨床可報告范圍為分析測量范圍的上限乘以稀釋倍數，即為50～15 000 U/mL。

表4 臨床可報告范圍評價結果表

2.6生物參考區間評價結果 積水KL-6試劑說明書聲明的生物參考區間為105.3～401.2 U/mL，參與驗證的74例體檢健康者的檢測結果中僅3例超出范圍，占4.05%，<5%(生物參考區間取95%CI)，驗證合格。

2.7分析干擾能力評價結果 將干擾物和對照空白液分別按要求用純化水預先溶解，將溶解好的干擾物1.0 mL與9.0 mL混合血漿混勻制成標本A，作為干擾標本；將溶解后的空白液1.0 mL與9.0 mL混合血漿混勻制成標本B，作為對照標本；將A和B按表6的要求配制成不同稀釋比例的標本，重復檢測2次取均值，并計算標本A、B間的偏差(干擾值),偏差(%)=(A-B)/B×100%,以偏差<10%作為是否存在明顯干擾的判定標準。見表5。通過添加系列水平的外源性干擾物對臨床常見的游離膽紅素、結合膽紅素、溶血血紅蛋白、乳糜微粒這4種干擾物對試劑盒檢測性能的干擾程度進行評價，以干擾值<10%作為判定標準，實驗結果顯示在游離膽紅素水平在20 mg/dL以下，結合膽紅素水平在20 mg/dL以下，溶血血紅蛋白在500 mg/dL以下，乳糜微粒在2 000 FTU以下對檢測結果的影響較小，干擾值<10%，見表6～9。

表5 干擾標本配置表

注：—表示無數據

表6 游離膽紅素干擾試驗結果

表7 結合膽紅素干擾試驗結果

表8 溶血血紅蛋白干擾試驗結果

表9 乳糜微粒干擾試驗結果

續表9 乳糜微粒干擾試驗結果

3 討 論

近年來，隨著我國科技的進步，實驗室診斷水平有了大幅提高，各種檢測儀器、體外診斷試劑盒基本能與發達國家同步使用。美國《臨床實驗室改進法規修正案》和我國《醫療機構臨床實驗室管理辦法》均規定[20]，新型試劑盒及各種檢測設備在應用于臨床之前，實驗室必須對檢測系統的主要分析性能進行評價，內容包括不精密度、正確度、分析測量范圍、臨床可報告范圍、檢測限等。隨著ISO15189實驗室認可在國內日益受到重視，廣大實驗室工作人員也對方法學性能評價有了更多的關注和認識，而實驗室檢測系統分析性能是否滿足臨床的需求，是開展質量管理工作的根本。因此,在新項目開展之前，應按要求對其進行方法學性能評價，以確保其分析性能滿足臨床的要求。

本研究依據行業指南或文獻報道，對血清KL-6檢測系統的不精密度、正確度、分析線性范圍、臨床可報告范圍、檢出能力、生物參考區間等進行了驗證，并對常見干擾物如膽紅素、溶血血紅蛋白、乳糜微粒等的抗干擾能力進行了初步的評估。實驗結果表明，血清KL-6檢測試劑盒在羅氏MODULAR P800生化分析儀上檢測的日內不精密度和日間不精密度均小于其試劑說明書聲明的10%。由于當前血清KL-6檢測方法中，尚無公認的參考物質和參考測量程序，也無合適的室間質評材料，所以在正確度評價方面[21]，本文依據當前實驗室技術水平，使用類似校準驗證的方式，采用KL-6檢測試劑盒說明書聲明的正確度允許偏差的1/2作為評價標準。參照CLSI EP6-A2標準，配置不同血清KL-6水平的6份標本，水平范圍覆蓋廠商聲明的線性范圍，實驗結果表明可接受50～5 000 U/mL作為儀器的分析檢測范圍。同時通過稀釋回收試驗驗證將接近線性范圍上限的標本進行3倍稀釋結果可靠，可以將線性范圍上限乘以稀釋倍數直接作為該項目的臨床可報告范圍的上限，從而將臨床可報告范圍拓展至50～15 000 U/mL；并根據CLSI EP17-A2的要求對血清KL-6的檢出限進行評估[17]，即使用標記水平為0的校準品對標本進行稀釋，獲得3份接近KL-6檢測下限的標本，按要求重復檢測，計算各自的CV，實驗結果顯示其不精密度在10.72%～11.63%，小于廠商試劑說明書的要求；在表觀健康體檢者中，74例只有3例超出，驗證合格。干擾試驗結果表明當游離膽紅素水平<20 mg/dL，結合膽紅素水平<20 mg/dL，溶血血紅蛋白<500 mg/dL、乳糜微粒<2 000 FTU時，對血清KL-6檢測的影響均<10%，可以接受。

4 結 論

綜上所述，本文驗證了日本積水血清KL-6試劑盒在羅氏MODULAR P800全自動生化分析儀上檢測性能符合試劑說明書聲明的要求，可以應用于實驗室的臨床檢測。本研究中采用的評價方法，對廣大基層實驗室工作人員也具有一定參考意義。