RANKL/RANK/OPG信號通路參與調控磷酸三鈣磨損顆粒誘導假體周圍骨溶解的研究

賀志強，楊亞帆，陳先州，劉乃澄，余勤武*

(1.仙桃市第一人民醫院骨外一科，湖北 仙桃 433000；2.蘇州大學附屬第一醫院骨科，江蘇 蘇州 215006)

關節置換術是治療關節損傷疾病的最重要手段，但假體周圍骨溶解導致人工關節無菌性松動仍是關節置換術后最常見的并發癥[1-2]。植入物釋放的聚乙烯、磷酸三鈣等特殊磨損顆粒通過刺激巨噬細胞，誘導種植體周圍顆粒狀炎癥，從而導致骨裂發生和隨后的骨溶解[3-4]。骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、NF-kappa B的受體激活因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)和RANK配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)在破骨細胞的生理和病理發育過程中均發揮著重要作用[5]。RANKL與RANK結合，促進破骨細胞活化[6]。OPG與RANK競爭RANKL，從而抑制破骨細胞生成和骨吸收[7]。研究表明，外源性OPG可以阻斷大鼠卵巢切除相關的骨質流失，提示其對骨質疏松癥等發生系統性骨質流失的疾病有重要作用[8]。然而OPG在局部病理性骨丟失中的作用還需要進一步研究。因此，本研究采用磷酸三鈣磨損顆粒誘導小鼠顱骨溶解模型，檢測OPG對假體周圍骨溶解的影響，探討RANKL/RANK/OPG信號通路在假體周圍骨溶解中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 昆明種小鼠(蘇州大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2017-0011)；磷酸三鈣磨損顆粒(浙江大學化學系)；OPG(美國Sigma公司)；3%戊巴比妥(購于上海上藥新亞藥業有限公司)；白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司，中國)、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司，中國)、PCR引物序列(大連TaKaRa公司，中國)：RANKL上游引物為5’-CACTATTAATGCCACCGAC-3’、下游引物為5’-GGGTATGAGAACTTGGGATT-3’；RANK上游引物為5’-ATGCGGTTTGCAGTTCTTCTC-3’、下游引物為5’-ACTCCTTATCTCCACTTAGG-3’；OPG引物序列：上游引物為5’-GCTTGAAACATAGGAGCTG-3’、下游引物為：5’-GTTTACTTTGGTGCCAGG-3’；GAPDH引物序列：上游引物為5’-CAGAACATCATCCCTGCCTCT-3’下游引物為：5-GCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG-3’；電子天平(上海梅特勒公司，中國)；組織脫水機、包埋機、全自動輪轉切片機等病理配套設備(德國Leica公司)；光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；HBS-1096B酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)；NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)、實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 實驗分組及造模 選取雄性6周齡小鼠30只，體重18～22 g，在SPF級的環境中飼養，動物相關處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求，適應性喂養1周后進行實驗。對小鼠進行編號，用隨機數字表法將小鼠隨機分為假手術組、模型組和OPG組，每組10只。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg體重)進行麻醉，剔除小鼠頭頂毛發，進行消毒，沿顱頂正中矢狀切口(10 mm左右)，分離皮下組織，暴露顱骨(大小約1 cm×1 cm)。假手術組在無任何進一步干預的情況下關閉切口。模型組和OPG組取30 mg磷酸三鈣磨損顆粒置于顱頂后關閉切口。OPG組于術后第2天在顱頂局部注射OPG(3 mg/kg)，每隔2天1次；假手術組和模型組給予等量生理鹽水，共2周。處死小鼠后進行相關檢測。

1.3 HE染色觀察破骨細胞 分離顱骨，進行甲醛固定48 h，用microCT掃描選顱骨相同位置的感興趣區域)進行三維重建；用10%鹽酸進行脫鈣，經脫水、包埋，切成厚度為3 μm切片，進行染色，在顯微鏡下觀察病理變化。選出一個具有代表性的圖像。用Image Pro-Plus 5.0計算矢狀縫區域3核及以上破骨細胞數。

1.4 TRAP染色觀察骨溶解 顱骨進行病理切片后，經脫蠟和乙醇梯度脫水后自然晾干，加入TRAP染色1h，雙蒸水清洗后置于顯微鏡下觀察小鼠顱骨溶解情況，用UTHSCA Image Tool測定骨溶解面積。

1.5 ELISA法檢測顱骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平 每組隨機取3只小鼠顱骨骨膜組織，剪碎后用RIPA裂解液進行裂解，12 000 r/min離心15 min后收集上清，按照ELISA試劑盒的操作說明書進行上述炎癥因子的檢測。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測顱骨中RANKL、RANK和OPG mRNA的水平 每組隨機取3只小鼠顱骨組織，剪碎后在液氮作用下充分研磨后加入Trizol 1 mL，根據RNA提取試劑盒操作說明書，加入氯仿、無水乙醇等試劑提取RNA，根據RNA反轉錄試劑盒說明書在37℃ 60 min，95℃ 5 min的逆轉錄條件下合成cDNA，將cDNA置于-20℃保存備用；根據熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR擴增，擴增條件為95℃預加熱15 min，一個循環；94℃ 15 s，65℃ 30 s，72℃ 34 s，40個循環。每個標本做3個復孔。用實時熒光定量PCR儀檢測對其表達量進行結果分析，以GADPH作為內參，采用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。

2 結 果

2.1 三組小鼠假體周圍破骨細胞形成和骨溶解的變化情況 與假手術組比較，模型組和OPG組小鼠顱骨破骨細胞數和骨溶解面積均增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，OPG組小鼠顱骨破骨細胞數和骨溶解面積均減少，差異有統計學意義(P<0.05，見表1，見圖1～3)。

表1 三組小鼠假體周圍破骨細胞形成和骨溶解的變化情況

a 假手術組 b 模型組 c OPG組

a 假手術組

b 模型組

c OPG組

a 假手術組

b 模型組

c OPG組

2.2 三組小鼠顱骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的變化情況 與假手術組比較，模型組和OPG組小鼠顱骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，OPG組小鼠顱骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平減少，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 三組小鼠顱骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的變化情況

2.3 三組小鼠顱骨中RANKL、RANK和OPG mRNA水平的變化情況 與假手術組比較，模型組和OPG組小鼠顱骨中RANKL、RANK、OPG mRNA的相對表達量均增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，OPG組小鼠顱骨中RANKL、RANK、OPG mRNA的相對表達量均降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

表3 三組小鼠顱骨中RANKL、RANK和OPG mRNA水平的變化情況

3 討 論

關節置換術中植入物長期失效的主要原因是關節面誘導的骨溶解導致無菌性松動[9]。破骨細胞形成關鍵介質(RANKL、RANK、OPG)的失衡與此過程有關[10]。本研究證明外源性OPG可以有效預防和治療磷酸三鈣磨損顆粒誘導的骨溶解。

磨損顆粒誘導骨溶解的小鼠模型是基于磨損顆粒和碎片[11]。本研究使用磷酸三鈣磨損顆粒，因為其是臨床實踐中最常見和與生物相關的磨損碎片來源之一，我們希望更真實地模擬臨床場景。在本研究中，模型組破骨細胞生成和骨吸收增強，遠高于假手術組水平。外源性OPG的加入顯著抵消了磨損顆粒的不良相關效應，提示OPG治療可有效抑制顆粒誘導的破骨細胞生成和骨吸收。

破骨前細胞需要表達RANK才能發育成成熟的破骨細胞，而表達RANK mRNA的細胞確實是從含有顆粒的翻修組織中分離出來的[12]。翻修組織中的單核細胞/巨噬細胞可能是破骨細胞的前體，因為來自不同組織的這個譜系的細胞可以在成骨細胞或溶血細胞存在的情況下分化為破骨細胞[13]。顆粒刺激單核細胞在體外表達RANK和RANKL，在體內表達巨噬細胞修飾組織，提示這些分子可能在關節周組織破骨細胞的產生中起關鍵作用[14]。雖然RANKL在關節周的水平可能是決定破骨形成的關鍵，但OPG的水平也很重要。眾所周知，OPG在破骨細胞前參與RANKL與其受體(RANK)結合的競爭[15]。由于RANKL/OPG比值失衡與假體周圍骨溶解伴無菌性松動密切相關，因此基因治療可能是一種潛在的治療策略[16]。RANKL/OPG比值被認為是調節骨吸收的關鍵參數，與多種骨代謝異常和骨紊亂相關。在以前的研究中，磨屑被證明能增加小鼠的RANKL和RANK水平[17]。如果提高OPG水平，那么RANKL的破骨作用將會減弱。同時，磨損顆粒可激活的巨噬細胞釋放TNF-α、IL-6和IL-1β等多種促炎細胞因子釋放[18]。這些炎癥因子的高水平表達可以通過其他信號通路激活成骨細胞的分化和成熟，誘導骨溶解，從而導致局部OPG表達的選擇性升高。然而，與假手術組相比，模型組中RANKL表達上調更為明顯，導致界面膜中RANKL/OPG比值顯著升高。給予內質網膜定位的活化轉錄因子6(ATF6)的特異性阻斷劑4-苯基丁酸能顯著減少小鼠假體周圍骨膜中IL-6、IL-1β、TNF-α和RANKL的產生，抑制骨溶解[19]。我們的研究也得出相似的結論。

綜上所述，通過給予外源性OPG能顯著抑制磷酸三鈣磨損顆粒誘導的骨溶解，為關節置換術后假體周圍骨溶解和關節松動治療提供了理論依據，可作為假體周圍骨溶解和關節松動新的干預和治療靶點，最終提高置換關節的壽命。