2-氧雜雙環(huán)[3,3,0]辛-6-烯-3-酮對映異構(gòu)體手性拆分及光學純度的測定

曹 宏,王淑紅,趙春影,胡川閩,蔡建輝,修志明

(1.吉林醫(yī)藥學院 吉林省抗體工程科技協(xié)同創(chuàng)新中心,吉林 吉林 132013；2.吉林大學 中日聯(lián)誼醫(yī)院,長春 130021；3.長春百純和成醫(yī)藥科技有限公司,長春 130012)

圖1 雙環(huán)內(nèi)酯對映異構(gòu)體Fig.1 Enantiomer of 2-oxabicyclo[3，3，0]oct-6-en-3-one

前列腺素(prostaglandins,PGs)是一類重要的內(nèi)源性生理活性物質(zhì),具有多種生理調(diào)節(jié)功能[1-2].其中PGF2α類似物(如拉坦前列素、曲伏前列素、他氟前列素等)微量使用即可發(fā)揮各種生理作用,是醫(yī)藥領(lǐng)域中的一類重要藥物[3-5].2-氧雜雙環(huán)[3,3,0]辛-6-烯-3-酮(簡稱雙環(huán)內(nèi)酯)是合成PGF2α類似物的重要中間體[6-11],該分子有2個手性中心,理論上存在4個對映異構(gòu)體.在實際生產(chǎn)中,根據(jù)反應機理推斷,僅存在一對對映異構(gòu)體,其結(jié)構(gòu)如圖1所示,其中A為(1S,5R)-2-氧雜雙環(huán)[3,3,0]辛-6-烯-3-酮(簡稱(-)-雙環(huán)內(nèi)酯),B為(1R,5S)-2-氧雜雙環(huán)[3,3,0]辛-6-烯-3-酮(簡稱(+)-雙環(huán)內(nèi)酯),(+)-雙環(huán)內(nèi)酯作為(-)-雙環(huán)內(nèi)酯對映異構(gòu)體雜質(zhì),若參與后續(xù)合成反應則會生成多種較難去除的雜質(zhì)[12].

隨著手性色譜填料多樣化,應用手性固定相的液相色譜法拆分及分析手性化合物日益廣泛[13],其中纖維素類手性固定相是一種高選擇性、高效、分離范圍廣的手性選擇子,也是目前應用和研究較多的手性固定相之一[14].本文選用多糖類直鏈淀粉衍生物手性柱OD-H直接拆分雙環(huán)內(nèi)酯對映體,可簡單、快速、準確地檢測雙環(huán)內(nèi)酯對映異構(gòu)體含量,對工業(yè)生產(chǎn)中前列腺素類藥物的質(zhì)量控制具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀(LC-2010AHT型,日本島津公司);核磁共振儀(AV400型,德國BRUKER公司);高分辨質(zhì)譜(Q-TofMS/MS型,美國Waters公司)；旋光度儀(XG004型,上海儀電科學儀器股份有限公司)；OD-H型手性柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm,美國BC公司).(-)-雙環(huán)內(nèi)酯、(+)-雙環(huán)內(nèi)酯和(±)-雙環(huán)內(nèi)酯樣品由長春百純和成醫(yī)藥科技有限公司提供；正己烷、正庚烷、異丙醇和無水乙醇為色譜純試劑(美國Tedia公司).

1.2 標準品和樣品

(-)-雙環(huán)內(nèi)酯(光學純度大于98%)、(+)-雙環(huán)內(nèi)酯(光學純度大于98%)和(±)-雙環(huán)內(nèi)酯(HPLC純度大于98%)樣品來自3個不同批次,樣品均用無水乙醇溶解稀釋至相應的質(zhì)量濃度.

1.3 方 法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：表面涂覆纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(OD-H)的硅膠柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)；流動相：V(正己烷)∶V(異丙醇)=95∶5等度洗脫；流速為0.8 mL/min；柱溫為25 ℃；紫外檢測波長為205 nm；進樣量為5 μL.

1.3.2 溶液的制備

1) 對照品溶液制備.分別精密量取(-)-雙環(huán)內(nèi)酯10 mg、(+)-雙環(huán)內(nèi)酯10 mg、(-)-雙環(huán)內(nèi)酯和(+)-雙環(huán)內(nèi)酯各10 mg,并分別置于100 mL 容量瓶中,用無水乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為(-)-雙環(huán)內(nèi)酯、(+)-雙環(huán)內(nèi)酯和(±)-雙環(huán)內(nèi)酯對照品儲備液.分別精密量取3種對照品儲備液各1 mL,加入10 mL容量瓶中,用無水乙醇稀釋至刻度,搖勻,配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的(-)-雙環(huán)內(nèi)酯、(+)-雙環(huán)內(nèi)酯和(±)-雙環(huán)內(nèi)酯對照品溶液.

2) 供試品溶液制備.分別精密量取3批次雙環(huán)內(nèi)酯樣品各10 mg,并分別置于100 mL容量瓶中,用無水乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為3份供試品儲備液.精密量取1 mL供試品儲備液加入10 mL容量瓶中,用無水乙醇稀釋至刻度,搖勻,作為3份雙環(huán)內(nèi)酯樣品的供試品溶液.

1.3.3 方法學驗證實驗

1) 系統(tǒng)適用性和穩(wěn)定性.分別對(-)-雙環(huán)內(nèi)酯和(+)-雙環(huán)內(nèi)酯對照品溶液進樣分析,記錄保留時間；取(±)-雙環(huán)內(nèi)酯混合對照品溶液,連續(xù)進樣5次,記錄峰面積,計算峰面積相對標準偏差(RSD)值、平均分離度及平均理論塔板數(shù).取(±)-雙環(huán)內(nèi)酯混合對照品溶液于0,18,24 h進樣5 μL進行液相色譜測定,記錄色譜圖,計算峰面積RSD值,并考察(±)-雙環(huán)內(nèi)酯混合對照品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性.

2) 線性關(guān)系和檢測限確定.在上述液相色譜條件下,取(±)-雙環(huán)內(nèi)酯混合對照品溶液,采用逐級稀釋法配制成質(zhì)量濃度分別為1,2,10,50,100 μg/mL的溶液,進樣5 μL,記錄色譜圖,按峰面積(A)與其質(zhì)量濃度(ρ,μg/mL)計算回歸方程.按儀器噪聲的3倍響應值確定(-)雙環(huán)內(nèi)酯和(+)雙環(huán)內(nèi)酯的檢測限.

3) 精密度和回收率.精密量取(±)-雙環(huán)內(nèi)酯混合對照品溶液5 μL,連續(xù)進樣5次,記錄峰面積,計算精密度.

從(±)-雙環(huán)內(nèi)酯混合對照品溶液中量取0.4,0.5,0.6 mL,分別加入5 mL(±)-雙環(huán)內(nèi)酯混合對照品溶液中,稀釋定容至10 mL.按測得質(zhì)量濃度和理論質(zhì)量濃度分別計算回收率.

1.3.4 對映異構(gòu)體過量測定 取質(zhì)量濃度為10 μg/mL的雙環(huán)內(nèi)酯樣品供試品溶液5 μL,置于液相色譜儀中,去除其余雜質(zhì)峰,用面積歸一化方法計算(-)-雙環(huán)內(nèi)酯和(+)-雙環(huán)內(nèi)酯的質(zhì)量分數(shù)及光學純度.對映體過量(ee%)的計算公式為

其中：a為(+)-雙環(huán)內(nèi)酯的面積百分數(shù),b為(-)-雙環(huán)內(nèi)酯面積百分數(shù).

2 結(jié)果與討論

圖2 系統(tǒng)適用性實驗Fig.2 Applicability experiment of system

分別將(-)-雙環(huán)內(nèi)酯對照品溶液和(±)-雙環(huán)內(nèi)酯樣品供試品溶液注入液相色譜儀中,所得色譜如圖2所示.由圖2可見,雙環(huán)內(nèi)酯樣品供試品溶液中(+)-雙環(huán)內(nèi)酯和(-)-雙環(huán)內(nèi)酯先后出峰,分離度為3.0.

2.1 系統(tǒng)適用性和穩(wěn)定性結(jié)果

測得液相色譜柱的平均理論塔板數(shù)以(+)-雙環(huán)內(nèi)酯峰計為13 950,以(-)-雙環(huán)內(nèi)酯峰計為12 877,即色譜系統(tǒng)適用于該液相色譜方法.對(±)-雙環(huán)內(nèi)酯混合對照品溶液進行液相色譜測定,測得(-)-雙環(huán)內(nèi)酯峰面積RSD為1.05%,(+)-雙環(huán)內(nèi)酯峰面積RSD為1.2%,表明(±)-雙環(huán)內(nèi)酯溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.2 線性關(guān)系和檢測限結(jié)果

(-)-雙環(huán)內(nèi)酯和(+)-雙環(huán)內(nèi)酯在1～100 μg/mL內(nèi),其峰面積(A)與質(zhì)量濃度(ρ,μg/mL)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程分別為

A=8 650.6ρ-1 745.1,R2=0.999；

A=8 701.7ρ-3 627.9,R2=0.999.

按儀器噪聲的3倍響應值確定(-)-雙環(huán)內(nèi)酯和(+)-雙環(huán)內(nèi)酯的檢測限,結(jié)果分別為0.1,0.05 μg/mL.

2.3 精密度測定結(jié)果

精密吸取(±)-雙環(huán)內(nèi)酯混合對照品溶液5 μL,連續(xù)進樣5次,記錄峰面積,測得(-)-雙環(huán)內(nèi)酯和(+)-雙環(huán)內(nèi)酯的RSD值分別為0.41%,0.24%,結(jié)果列于表1.

從(±)-雙環(huán)內(nèi)酯混合對照品儲備液中分別量取0.4,0.5,0.6 mL,加入5 mL(±)-雙環(huán)內(nèi)酯混合對照品溶液中,稀釋定容至10 mL,按測得質(zhì)量濃度和理論質(zhì)量濃度分別計算回收率,結(jié)果列于表2.由表2可見: (-)-雙環(huán)內(nèi)酯的平均加標回收率為99.6%～101%,RSD為0.46%～0.90%；(+)-雙環(huán)內(nèi)酯的平均加標回收率為99.5%～100%,RSD為0.67%～1.01%.

表1 雙環(huán)內(nèi)酯的精密度實驗結(jié)果

表2 雙環(huán)內(nèi)酯的回收率實驗結(jié)果

上述方法學考察結(jié)果表明,該方法可準確測定(-)-雙環(huán)內(nèi)酯或(+)-雙環(huán)內(nèi)酯的質(zhì)量濃度.

2.4 對映異構(gòu)體過量測定結(jié)果

對3批次(±)-雙環(huán)內(nèi)酯樣品的供試品溶液進行測定,計算光學純度,結(jié)果列于表3.由表3可見，3份(±)-雙內(nèi)酯樣品能進行有效分離，光學純度分別為-98%,-99%和98%.

表3 雙環(huán)內(nèi)酯的光學純度

2.5 手性色譜填料的選擇

纖維素類手性色譜填料有：表面涂敷直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅膠、表面涂敷直鏈淀粉-三((S)-α-甲基苯基氨基甲酸酯)硅膠、表面共價鍵合直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅膠、表面共價鍵合直鏈淀粉-3-氯苯基氨基甲酸酯硅膠等.實驗結(jié)果表明,選用手性填料表面涂敷纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅膠可使雙環(huán)內(nèi)酯的分離度達3.0,可有效分離,故選用手性色譜柱BCOD(250 mm×4.6 mm,5 μm).

2.6 流動相的選擇

采用手性色譜柱BCOD(250 mm×4.6 mm,5 μm),正相混合溶劑為流動相的烷烴-多元醇混合溶劑,烷烴分別選用正己烷和正庚烷等,多元醇分別選用甲醇、無水乙醇和異丙醇等,最終確定V(正己烷)∶V(異丙醇)=95∶5為最佳流動相比例.

2.7 流速的選擇

使用手性色譜柱BCOD(250 mm×4.6 mm,5 μm),在V(正己烷)∶V(異丙醇)=95∶5的流動相下,考察流速對雙環(huán)內(nèi)酯對映異構(gòu)體分離度及保留時間的影響.為保證檢測的時間效率,使雙環(huán)內(nèi)酯對映異構(gòu)體在60 min內(nèi)全部出峰,確定考察流速為(0.3～1.0)mL/min.當流速為0.3 mL/min時,雙環(huán)內(nèi)酯對映體構(gòu)體二者的分離度為5.7,(-)-雙環(huán)內(nèi)酯保留時間為42.2 min,(+)-雙環(huán)內(nèi)酯保留時間為43.6 min.增大流速,雙環(huán)內(nèi)酯對映異構(gòu)體的保留時間逐漸減小,對分離度影響較小,但二者中間有雜質(zhì)峰出現(xiàn),可見流速僅影響單個對映異構(gòu)體的分離度.最終確定流速為0.8 mL/min,分離度最好且檢測時間在25 min內(nèi).

2.8 柱溫的選擇

分別將柱溫設(shè)為20,25,30,35,40 ℃,對雙環(huán)內(nèi)酯對映異構(gòu)體進行分析分離.結(jié)果表明：隨著溫度的上升,分離度逐漸減小.25 ℃時分離度較好,且接近室溫,易操作,因此選擇柱溫為25 ℃.

綜上所述,本文以表面涂覆纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)硅膠的纖維素類手性為固定相,以V(正己烷)∶V(異丙醇)=95∶5為流動相,當流速為0.8 mL/min,柱溫為25 ℃,檢測波長為205 nm時,雙環(huán)內(nèi)酯對映異構(gòu)體實現(xiàn)了較好的分離,分離為3.0,并用面積歸一化方法確定了對映體過量值.該方法具有簡單、準確、快速的優(yōu)點,為前列腺素類藥物質(zhì)量控制提供了一種新方法.