重組人源抗血管內皮生長因子單克隆抗體的制備及鑒定

董 雪,徐雨昕,郭 晶,龔忠闊,夏霖亞,殷玉和,吳叢梅

( 1.長春工業大學 化學與生命科學學院,長春 130012；2.東北農業大學 生命科學學院,哈爾濱 150030)

人源抗血管內皮生長因子(VEGF)通過與血管內皮細胞相應的受體結合,刺激血管內皮細胞的增殖和遷移,誘導形成新生血管,使腫瘤持續生長[1-4].抗VEGF單克隆抗體通過中和VEGF因子,阻斷其與內皮細胞表面VEGF受體結合,從而抑制內皮細胞的增殖與遷移[5-7].因此,抗VEGF抗體成為抗腫瘤血管治療的重要研究方向.這類新藥可通過阻斷微血管的形成和生長達到抑制腫瘤細胞生長或維持腫瘤處于休眠期的目的.目前VEGF抗體藥物對肺癌、乳腺癌和結腸癌等血管生成具有較好的阻斷作用[8],作為新藥研發的主要靶標已引起人們廣泛關注[9-10].

本文先獲得人源化抗VEGF抗體可變區蛋白序列,通過密碼子優化得到其DNA序列,再與人源抗化VEGF抗體恒定區DNA序列連接,并在其前端設計信號肽,得到多條人源化抗VEGF抗體重鏈輕鏈序列,其中一對表達量和生物效應較好,可進一步擴大培養.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HEK-293,HEK-293F,C6細胞由長春工業大學細胞生物實驗室保存,常規培養;pcDNA3.1+質粒由長春工業大學細胞生物實驗室保存;質粒大提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；轉染試劑(美國 Polysciences公司)；內切酶(大連Tokava生物技術公司)；辣根過氧化物酶(HRP)兔抗人IgG(北京索萊寶公司)；標準品(美國Roche公司)；培養基,血清(美國Gibco公司).

酶標儀(model680型美國BIO-RAD公司)；Transwell小室(美國Corning公司).

1.2 方 法

1.2.1 HEK-293F瞬時轉染 HEK-293F細胞以0.8×106個/mL接種,123 mL懸浮培養.20 μg質粒與60 μg PEI室溫孵育15～20 min,將其混合液混勻快速加入細胞懸液中,同時設空白對照組和pcDNA3.1+載體對照組.培養24 h可檢測轉染效率,分別在48,96,144 h后加入補料培養基,當細胞存活率降至約60%時,離心收取細胞上清液,純化.

1.2.2 抗體蛋白分離純化 pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達載體共同轉染HEK-293F細胞,轉染不同時間后細胞培養上清液經Protein A親和層析柱純化.細胞表達上清液樣品進行離心及0.45 μm濾膜過濾.用10倍柱體積的結合緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4,0.15 mol/L NaCl,pH=7.0)平衡層析柱,流速為1 mL/min.最后加入洗脫緩沖液(0.1 mol/L甘氨酸鹽酸緩沖液,pH=2.7)洗脫.用4 mL EP管收集洗脫的樣品,每管2.4 mL,每EP管內需預先加入中和緩沖液(1 mol/L Tris-HCl,pH=9.0) 600 μL,進行收集.

1.2.3 SDS-PAGE檢測蛋白表達 pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達載體共同轉染HEK-293F細胞,pCDNA3.1+質粒轉染作為對照組.轉染48 h后取等量細胞蛋白上清液,進行質量分數為12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結束后將分離膠置于考馬斯亮藍溶液中染色,染色30 min后,加脫色液脫色至背景無色,保存干膠.SDS-PAGE電泳圖中蛋白通過Quantity One軟件進行純度測定.

1.2.4 細胞共培養 六孔板內接種C6細胞(3×105個/孔),同時將HEK-293細胞接種于0.45 μm的Transwell小室.C6細胞貼壁后,將pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達載體共同轉染HEK-293細胞,轉染后6 h與C6細胞共培養.同時設pCDNA3.1+質粒對照組,培養48 h后用噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖.

1.2.5 抗體蛋白活性檢測 六孔板內接種C6細胞(3×105個/孔),細胞貼壁后,將不同質量濃度的蛋白加入細胞中,同時設標準品對照組和正常細胞組[5].培養48 h后用MTT法檢測細胞增殖.

1.2.6 MTT檢測細胞增殖 六孔板每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)100 μL,于CO2培養箱中繼續孵育3.5 h后終止培養.吸凈孔內培養上清液,每孔加1 mL二甲基亞砜(DMSO),振蕩10 min使結晶物充分溶解；用酶標儀于570 nm波長測OD值,記錄結果.

2 結果與討論

2.1 設計并優化抗VEGF抗體重鏈及輕鏈基因序列

人源抗VEGF抗體可變區序列為已公開專利中提供的序列(專利號：EP2792687A1),在NCBI網站Ig BLAST在線工具對其進行密碼子優化,用軟件RNA structure 預測經密碼子優化后目的基因二級結構,用SingalP3.0信號肽預測軟件對輕、重鏈可變區信號肽進行分析,與人重鏈和人輕鏈恒定區DNA序列組裝,并在5′端和3′端分別設計NheⅠ和EcoRⅠ酶切位點,得到抗VEGF抗體重鏈和輕鏈各一條.基因由北京君諾德生物技術有限公司合成.其蛋白序列及基因序列為

重鏈蛋白: MYRIQLLSCIALSLALVTNSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSINGSWIFWVRQAPGKGLEWVGAIWPFGGYTHYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGHSTSPWAMDYWGQGTLVASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;

重鏈DNA: ATGTACCGGATCCAGCTGCTGTCCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGGGGGGGACTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCTCTGGCTTTTCTATCAATGGCTCCTGGATTTTCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTGGGAGCTATTTGGCCCTTTGGGGGATACACCCATTACGCCGACAGTGTCAAGGGCAGGTTCACCATTTCTGCCGACACCAGCAAGAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATGGGGACACAGCACAAGCCCTTGGGCCATGGACTACTGGGGACAAGGAACACTGGTGGCCAGCACCAAAGGCCCAAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTCTTCTAAGAGCACCAGCGGAGGTACAGCCGCCCTGGGATGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATTCTCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACTCAGACTTACATCTGTAACGTGAACCACAAACCTTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCATACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCTGAACTGCTGGGAGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGTACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTCGTGGACGTCTCCCACGAAGATCCCGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTCGACGGCGTTGAAGTCCACAACGCCAAAACCAAACCCCGCGAGGAGCAATACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTACAAATGTAAGGTGAGCAACAAGGCACTGCCCGCCCCTATAGAGAAAACCATCAGCAAAGCCAAGGGACAGCCCAGAGAACCCCAAGTGTACACACTGCCCCCCAGCAGAGACGAACTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTCACCTGCCTCGTGAAAGGATTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAACCCGAGAACAACTACAAAACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAACTCACCGTCGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCTCCCGGCAAGTACTGA;

輕鏈蛋白: MYRIQLLSCIALSLALVTNSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQVIRRSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNTSPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC;

輕鏈DNA: ATGTACCGGATCCAGCTGCTGTCCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCCCTGAGCGCCTCCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGCAGAGCCTCCCAGGTTATCAGAAGAAGCCTGGCCTGGTACCAGCAAAAGCCCGGCAAAGCCCCCAAGCTGCTCATCTACGCCGCCTCAAACCTGGCCAGCGGAGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTCACCATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAATCCAACACCAGCCCCCTGACCTTCGGACAGGGCACCAAAGTCGAAATCAAGAGAACCGTCGCCGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCCTCCGACGAACAACTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTCGTGTGCCTGCTCAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTTGATAACGCCCTGCAGAGCGGCAACTCCCAGGAGAGCGTGACCGAACAGGATAGCAAGGACTCTACCTACTCTCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTCACACACCAAGGCCTGAGCAGCCCCGTCACCAAAAGCTTCAACCGCGGCGAGTGCTACTGA.

2.2 構建表達載體

將重鏈、輕鏈基因分別連接進入pcDNA3.1+表達載體NheⅠ和EcoRⅠ位點,構建成pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達載體.表達載體鑒定結果如圖1所示.由圖1可見: pcDNA-VEGFH表達載體分別用NheⅠ+EcoRⅠ和BamHⅠ+EcoRⅠ雙酶切,有約700 bp目的條帶；pcDNA-VEGFV表達載體分別用NheⅠ+EcoRⅠ和BamHⅠ+EcoRⅠ雙酶切,有約250 bp目的條帶.結果表明，表達載體構建正確.

2.3 VEGF抗體大量表達特性

將pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達載體共轉染HEK-293F細胞,用SDS-PAGE方法檢測不同時間蛋白表達水平,結果如圖2所示.由圖2可見,50 000,25 000附近可見明顯的蛋白表達帶,轉染后24～144 h均有重鏈和輕鏈蛋白表達.

1：pcDNA-VEGFH/NheⅠ+EcoRⅠ；2：pcDNA-VEGFH/BamHⅠ+EcoRⅠ；3：pcDNA-VEGFH；4：DL10000；5：pcDNA-VEGFV；6：pcDNA-VEGFV/NheⅠ+EcoRⅠ；7：pcDNA-VEGFH/BamHⅠ+EcoRⅠ.圖1 pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達載體酶切鑒定Fig.1 Identification of pcDNA-VEGFH and pcDNA-VEGFV expression vectors

1: Marker；2.對照組；3～8: 分別轉染24,48,72,96,120,144 h.圖2 pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV共轉染 HEK-293F細胞上清液蛋白表達Fig.2 Protein expression of HEK-293F cells transfected with pcDNA-VEGFH and pcDNA-VEGFV in cell culture supernate

圖3 共培養對C6細胞增殖的影響Fig.3 Effect of co-cultured on proliferation of C6 cells

2.4 重組基因表達產物活性檢測

將pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達載體共轉染HEK-293細胞后,與C6細胞共培養.用MTT法檢測C6細胞的增殖特性,結果如圖3所示.由圖3可見,pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達載體共轉染HEK-293細胞并與C6細胞共培養,可顯著抑制C6細胞增殖(P<0.01).

2.5 VEGF抗體分離純化及檢測

將pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達載體共轉染HEK-293F細胞,轉染后培養96 h,提取上清液,用Protein A親和層析柱純化方法純化.SDS-PAGE檢測蛋白純化結果如圖4所示.由圖4可見,洗脫后的抗體分別在50 000,25 000附近得到明顯蛋白表達帶,與抗體輕鏈和重鏈分子量相符,在流川處無目的條帶,表明純度較高.用Protein A親和層析柱純化抗VEGF抗體,以VEGF165蛋白為抗原,以純化的抗VEGF抗體為一抗,并以標準品作為對照,進行Western-blot檢測,結果如圖5所示.由圖5可見,所得抗體與標準品一致.

1: Marker;2: 標準品;3: 原樣;4: 流川;5: 洗脫1;6: 洗脫2.圖4 SDS-PAGE檢測純化蛋白Fig.4 Detection of purified protein by SDS-PAGE

1: Marker;2: VEGF抗體蛋白;3: 空白對照;4: 標準品.圖5 Western-blot檢測純化蛋白Fig.5 Detection of purified protein by Western-blot

2.6 VEGF抗體生物活性檢測

將分離純化獲得的抗體以不同質量濃度加入C6細胞中,48 h后用MTT法檢測細胞增殖,結果如圖6所示.由圖6可見: 不同劑量抗體蛋白對C6細胞增殖均有抑制作用,2～20 μg/mL組抑制作用明顯(P<0.05～0.01);相同劑量的抑制效果與標準品(10 μg/mL)相近.

圖6 不同質量濃度抗體對C6細胞增殖的影響Fig.6 Effect of different mass concentrations of antibodies on proliferation of C6 cells

綜上,本文首先獲得人源抗VEGF抗體可變區序列,利用NCBI在線平臺及相關數據庫進行密碼子優化,并與信號肽[11-13]、人重鏈和人輕鏈恒定區DNA序列組裝,得到了多條抗VEGF抗體重鏈和輕鏈[14-16],其中一對表達效果較好；其次，其用PEI介導的瞬時轉染到HEK-293細胞表達合成抗體蛋白[17-19]，結果表明，質量濃度為2～20 μg/mL的抗體均可明顯抑制C6細胞增殖(P<0.05～0.01).標準品與相同劑量實驗組的結果相似.