NEBL基因錯義突變導致擴張型心肌病一家系研究

呂永楠，王京偉

擴張型心肌病(DCM)是以左心室擴大伴心功能下降為主要特征的心肌病，目前認為35%的擴張型心肌病與基因突變有關[1]。心內膜纖維彈性組織增生是罕見的心肌結構紊亂，常發(fā)生于嬰兒或年輕患者，預后差[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)X染色體或常染色體遺傳是導致心內膜纖維彈性組織增生的可能病因[3]。Nebulin蛋白是一組肌動蛋白結合蛋白，它結合了單個肌動蛋白亞基，并參與了原肌鈣蛋白的組裝[4]。在心肌中特異表達Nebulin家族蛋白的是Nebulette(NEBL)基因，參與了心肌組織的早期發(fā)生及構成肌纖維組織[5-6]，NEBL基因多態(tài)性與非家族性擴張型心肌病有關[7]。本研究對1例年輕擴張型心肌病患者進行基因篩查，發(fā)現(xiàn)其NEBL基因突變，并對其家系成員進行了基因篩查，為早期篩查和干預擴張型心肌病提供候選基因，并進一步提示NEBL基因突變與擴張型心肌病相關性。

1 臨床資料

患者，男，23歲，患者近1個月以來反復感冒，活動后自覺胸悶喘氣不適，伴有乏力、心慌，活動耐量較前明顯下降，患者于外院給予抗感染治療后癥狀緩解不明顯，近1周患者自覺上述癥狀加重，伴夜間不能平臥入睡。查體：T 36.5 ℃，R 18次/min，P 82次/min，BP 124/82 mmHg。神清，精神可，全身皮膚黏膜未見出血點、黃染，全身淺表淋巴結未及腫大，頸靜脈無怒張，頸軟，雙肺呼吸音清，右下肺可聞及濕啰音。HR 82次/min，律齊，未聞及明顯雜音。腹平軟，無壓痛及反跳痛，肝脾肋下未及，雙腎區(qū)無叩痛，雙下肢無水腫。心臟超聲檢查：LAD 45 mm，LVDD 63 mm，RAD 40 mm，RVD 23 mm，LVEF 37%。NT-proBNP 6 732 ng/L。

經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會批準后，先證者及其家屬成員均知情同意并簽署知情同意書，然后進行血液標本收集，相關操作均符合倫理委員會要求和赫爾辛基宣言。詳細詢問先證者及其家屬成員病史、家族史，根據(jù)患者描述，制作患者家系系譜圖，對先證者進行體格檢查、血液指標、心臟超聲和心電圖等檢查，對家族成員行心臟超聲檢查。由武漢大學人民醫(yī)院臨床分子診斷中心對先證者候選致病基因全外顯子高通量測序，獲得可疑突變后，利用Sanger測序驗證家系成員是否存在可疑突變。

Ⅰ2 和Ⅰ3死亡原因不明，Ⅱ2是先證者父親，心臟超聲檢查：LAD 32 mm，LVDD 46 mm，RAD 36 mm，RVD 38 mm，LVEF 60%。Ⅱ3是先證者母親，心臟超聲檢查：LAD 30 mm，LVDD 43 mm，RAD 38 mm，RVD 33 mm，LVEF 70%。Ⅲ2是先證者弟弟，年齡13歲，目前未發(fā)病。Ⅰ1、Ⅰ4、Ⅱ1、Ⅱ4目前體健，未發(fā)現(xiàn)擴張型心肌病，見圖1。

注：□正常男性；○正常女性；■已故男性死因不明；●已故女性死因不明；患病男性；→先證者

圖1 先證者及其家系圖

候選基因篩查結果：實驗室對受檢者外周血提取基因組DNA采用Life technologies公司Ion PGM高通量測序儀檢測ACTN2，LMNA，NEXN，PCSK9，PSEN2，TNNT2，TWIK-1，ANKRD1，BAG3，LDB3，MYPN，NEBL，RBM20，VCL，CRYAB，CSRP3，MYBPC3，MYL2，PKP2等65個遺傳性心肌病相關基因，并使用Ion Reporter數(shù)據(jù)分析軟件對測序結果進行分析，受檢者共發(fā)現(xiàn)525個變異，通過分析ClinVar數(shù)據(jù)庫、UCSC數(shù)據(jù)庫Common SNPs、dbSNP數(shù)據(jù)庫及1000-genome-project MAF小于等于1%的罕見突變，濾除無功能的同義突變和內含子突變，發(fā)現(xiàn)5個候選有害或可能有害突變位點進行OMIM數(shù)據(jù)庫檢索、HGMD數(shù)據(jù)庫檢索及PubMed數(shù)據(jù)庫文獻分析，初步認為NEBL基因的p.Ser429Leu變異，GATAD1基因的p.Thr71fs變異，與受檢者擴張型心肌病關系可能性最大。經(jīng)Sanger測序驗證，NEBL基因的p.Ser429Leu變異為真性變異, GATAD1基因的p.Thr71fs變異為假性變異，見表1。

家系成員Sanger測序結果：根據(jù)先證者候選基因篩查結果，對獲取的家族人員血液標本進行NEBL c.1286C>T(p.Ser429Leu)測序，結果提示Ⅱ2和Ⅱ3是突變基因攜帶者，見圖2。

圖2 Sanger法序列驗證先證者和家系成員結果

2 討 論

擴張型心肌病的遺傳模式主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，但少部分也存在其他遺傳模式如常染色體隱性遺傳、X連鎖遺傳和線粒體DNA遺傳。其中約75%的擴張型心肌病患者都集中在TTN、MYH7、MYBPC3、LMNA、SCN5A、TNNT2、TNNI3、MYH6和PLN等基因[8-10]。但本研究通過基因測序發(fā)現(xiàn)，本例年輕擴張型心肌病患者存在NEBL基因突變，是較為罕見的致病基因。

表1 先證者基因突變結果

目前研究發(fā)現(xiàn)心肌病患者中編碼心肌結構蛋白基因突變，尤其是編碼細胞骨架和肌動蛋白，包括Z盤蛋白，可能是導致擴張型心肌病發(fā)生最終的共同通路[11]。NEBL是肌小節(jié)Z盤蛋白，通過與肌動蛋白和原肌鈣蛋白復合物相互作用從而參與心肌機械傳感和心肌收縮。因此，NEBL基因突變是擴張型心肌病致病基因之一。

Purevjav等[12]研究發(fā)現(xiàn)擴張型心肌病患者中NEBL基因突變(K60N、Q128R、G202R和A592E)中發(fā)現(xiàn)肌小節(jié)和Z盤表達異常，會導致患者出現(xiàn)一系列心臟表型和不同的疾病嚴重程度，以及不同程度的心臟功能損害的臨床表現(xiàn)。

Maiellaro-Rafferty等[13]研究證實，在NEBL轉基因小鼠動物試驗中，NEBL基因突變是心肌結構和機械改變導致心肌動力學改變的早期標志。研究還發(fā)現(xiàn)處于潛伏期的小鼠DCM模型，NEBL基因突變導致肌鈣蛋白表達和定位異常，會顯著影響鈣離子調控和機械壓力反應。

本研究中發(fā)現(xiàn)先證者存在NEBL基因突變，突變位點位于 c.1286C>T(p.Ser429Leu)。患者癥狀、實驗室檢查和心臟超聲均提示DCM伴有心功能不全，NEBL基因c.1286C>T(p.Ser429Leu)突變?yōu)殄e義突變，先證者、Ⅱ2和Ⅱ3均是此基因的攜帶者，但是Ⅱ2和Ⅱ3目前無明顯癥狀，心臟超聲檢查未發(fā)現(xiàn)心臟腔室結構異常和功能下降，可能為遺傳異質性導致，但是相關研究提示NEBL基因突變具有潛在發(fā)展為DCM可能性，對于Ⅱ2和Ⅱ3應該定期行心臟超聲檢查或心臟MR檢查評估心臟腔室結構，以利于早期干預患者，延緩病情進展。

遺傳因素在DCM病理發(fā)展過程中起到重要的作用，特別是年輕患者，從基因水平尋找DCM發(fā)病機制具有重要的意義，能夠早期輔助臨床診斷疾病，并預測該患者臨床預后，制定個體化診療方案，將為基因診斷和治療DCM開辟新的途徑。但是目前臨床實踐中，基因檢測仍然面臨著許多問題和挑戰(zhàn)，如基因型和表型之間的差異，隨著新一代基因檢測技術的發(fā)展，分子遺傳的研究將有助于明確基因型和表型之間的關系。