miR-218和Survivin基因/蛋白在喉癌中的表達及其與喉癌化療敏感性的關系

要兆旭，馮志星，彭麗娜，韓海平，赫莉，楊雪

喉癌是頭頸部較為常見的惡性腫瘤之一，多發于50～70歲男性。在我國，喉癌的發病率呈增長趨勢，其治療方法以手術切除為主，聯合術前或術后化療、放療等綜合治療[1]。但由于個體差異大，化療的療效尚不確定，所以，如何選擇合適的生物學指標預測化療的療效受到研究者們的重視。微小核糖核酸-218(miR-218)是一種小分子非編碼RNA，在胃癌、結直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達降低[2-4]，其低表達與腫瘤患者預后不良相關，可作為疾病診治和預后判斷的生物學指標。存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族中結構獨特的新成員，具有較強的抗凋亡作用。研究發現，Survivin在膀胱癌、胃癌、食管鱗狀細胞癌等腫瘤中升高[5-7]，參與腫瘤發生發展過程，是潛在的腫瘤治療靶點[8]。下調Survivin表達可增強腫瘤細胞對化療誘導的細胞凋亡敏感性[9]。有研究報道，miR-218可通過下調Survivin表達調控宮頸癌腫瘤細胞克隆形成、遷移和侵襲從而抑制宮頸癌的發展進程[10]。目前，miR-218是否也通過調控Survivin表達參與喉癌的發生和發展，以及二者表達與喉癌敏感性的相關研究還較少。本研究選取85例喉癌患者為研究對象，于治療前取各患者喉癌活檢組織標本，探討miR-218和Survivin表達與喉癌化療敏感性的關系，為喉癌化療療效的預測提供一定的理論依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年2月—2015年8月邯鄲市中心醫院耳鼻喉頭部外科收治首次確診為喉癌患者85例為研究對象，其中男68例，女17例，年齡30～85(63.17±8.25)歲；吸煙者54例，未吸煙者31例；腫瘤直徑>3 cm者43例，≤3 cm者42例；按照TNM分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期32例，Ⅲ期24例，Ⅳ期6例；依據腫瘤分化程度：高分化26例，中分化35例，低分化24例；按照病理類型：鱗癌81例，腺癌4例；發生淋巴結轉移者36例，未轉移者49例。排除標準：(1)合并心臟、腎、肝等器官疾病患者；(2)合并糖尿病患者；(3)合并自身免疫疾病、精神病患者。以同期本院病理科30例正常喉黏膜組織石蠟切塊作為對照，其中男23例，女7例，平均年齡(62.15±7.39)歲。本研究經醫院倫理委員會批準，全部受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 實驗試劑及儀器 Trizol試劑購自上海慧穎生物科技有限公司；反轉錄及PCR試劑盒購自日本Takara公司；免疫組化檢測試劑均購自于武漢博士德公司。TP600型PCR 擴增儀購自日本 Takara公司；LC 480型Real-time PCR儀購自美國羅氏公司。

1.3 miR-218和Survivin mRNA表達檢測 采用實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real time polymerase chain reaction，RT-qPCR)技術檢測miR-218和Survivin mRNA表達，按照Trizol試劑說明書提取標本組織中總RNA，用DEPC處理過的超純水溶解。分光光度計檢測RNA溶液在260 nm和280 nm處吸光值(A)，計算RNA的濃度和純度，A260/A280比值>1.8可用于檢測miR-218和Survivin mRNA表達。將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行擴增。miR-218上游引物5' -ACACTCCAGCTGGGTT-3' ，下游引物5' -TGGTGTCGTGGAGTCG-3' ；Survivin上游引物5' -AAGAGGCGGCAACAGATT-3' ，下游引物5' -GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3' ；U6上游引物5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3' ，下游引物5' -AACGCTTCACGAATTTG-3' ；β-actin上游引物5' -CCTGTACGCCAACACAGTGC-3' ，下游引物5' -ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3' 。反應條件：95℃預變性5 min后，95℃30 s， 60℃30 s，72℃30 s，總計40個循環。采用2-△△Ct法，分別以U6和β-actin為內參計算miR-218和Survivin mRNA相對表達水平。

1.4 Survivin蛋白表達檢測 采用免疫組織化學法Envision二步法，嚴格按照產品操作說明書進行。以PBS代替一抗作為陰性對照。Survivin蛋白表達主要定位于細胞質，小部分定位于細胞核。隨機選取5個高倍鏡視野，計數陽性細胞數和細胞總數。(1)按陽性細胞所占的百分比計分：<10%(0分)，10%～25%(1分)，26%～50%(2分)，>50%(3分)；(2)按染色強度計分：無色(0分)，淡黃色(1分)，棕黃色(2分)和棕褐色(3分)。取2項結果的乘積，≤3分為Survivin蛋白陰性表達，>3分為Survivin蛋白陽性表達。

1.5 化療方法 喉癌組患者均于術后4～6周開始化療，順鉑20～25 mg/m2靜脈滴注，每天1次，共3 d；甲酰四氫葉酸鈣100 mg靜脈滴注，每天1次，共5 d； 5-氟尿嘧啶靜脈滴注500～750 mg/m2，每天1次，共5 d；平陽霉素8 mg溶于20 ml生理鹽水靜脈注射，每天1次，共4 d。每月循環1次，共3個月。

1.6 療效判斷標準 根據改良的實體瘤療效評價標準(mRECIST)進行療效評估[11]，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)和疾病進展(PD)。CR：所有目標病灶消失，無新病灶出現，腫瘤標志物水平正常，并維持4周；PR：所有目標病灶的長徑總和減少≥30%，并維持4周；PD：所有目標病灶的長徑總和增加≥20%，并且長徑總和增加的絕對值超過5 mm，或者有新病灶出現，或者病灶數量增加；SD變化介于PR和PD之間。術后輔助化療敏感類包括CR和PR患者，不敏感類包括SD和PD患者。

2 結 果

2.1 miR-218和Survivin mRNA表達比較 qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組比較，喉癌組織中miR-218表達顯著降低(1.06±0.18 vs. 0.62±0.17，t=12.003,P<0.01)，Survivin mRNA表達顯著升高(1.08±0.21 vs. 1.72±0.24，t=12.953,P<0.01)，見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.01

圖1 喉癌組織與正常喉組織miR-218和Survivin mRNA表達比較

2.2 Survivin蛋白表達比較 免疫組化結果顯示Survivin主要定位于細胞質，胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性反應，喉癌組陽性顆粒較多，對照組則陽性表達很少(圖2見封3)。喉癌組織中Survivin蛋白陽性表達率為45.88%(39/85)，對照組Survivin蛋白陽性表達率為16.67%(5/30)。與對照組比較，喉癌組織中Survivin蛋白陽性表達率顯著升高(χ2=8.012,P<0.05)。

2.3 miR-218和Survivin mRNA表達與喉癌患者臨床病理特征的關系 以喉癌組患者 miR-218和Survivin mRNA表達的平均數0.31、 0.86為分界點，將85例患者分為miR-218低表達組42例、miR-218高表達組43例；Survivin低表達組46例、Survivin高表達組39例。miR-218和Survivin mRNA表達均與腫瘤直徑大小、TNM分期、分化程度及淋巴結是否轉移相關(P<0.05)，而與喉癌患者性別、年齡、是否吸煙及病理類型無關(P>0.05)，見表1。

2.4 miR-218和Survivin mRNA表達的相關性 生物信息學分析發現，癌基因Survivin是miR-218的下游潛在作用靶點之一[12]。Spearman相關性分析結果顯示，喉癌組織中miR-218和Survivin mRNA表達呈明顯負相關(r=-0.534，P<0.05)，見圖3。

注：A.miR-218和Survivin mRNA互補序列；B.喉癌組織中miR-218和Survivin mRNA表達相關性

圖3 miR-218和Survivin mRNA表達相關性

2.5 miR-218和Survivin mRNA表達與喉癌化療敏感性的關系 經過3個月治療后，CR、PR、SD和PD患者分別有20例、41例、17例和7例。miR-218高表達患者中對化療敏感人數占總化療敏感人數的59.02%，低表達患者占40.98%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。Survivin高表達患者中對化療敏感人數占總化療敏感人數的37.70%，低表達患者占62.30%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。與化療不敏感患者相比，化療敏感患者miR-218表達顯著升高(P<0.05)，Survivin表達顯著降低(P<0.05)，見表2、圖4。

注：與化療不敏感患者比較，aP<0.05

3 討 論

喉癌是常見的影響患者健康的頭頸部惡性腫瘤。化療在惡性腫瘤的治療中起重要作用，化療療效依賴于腫瘤細胞對抗癌藥物的敏感性[13]。導致化療失敗的原因比較復雜，涉及到多種機制，如某些影響細胞生長、凋亡的基因分子可影響腫瘤化療的敏感性[14]。尋找準確、快速和靈敏的生物學指標預測不同喉癌患者對化療的敏感性，依據化療敏感性的不同制定不同的化療方案，使患者從中受益意義重大。

miRNA是一類內源性非編碼小RNA，通過轉錄后水平調控RNA表達，參與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移等生物學行為的調控過程。近年來研究表明，miR-218作為基因表達調控因子，與腫瘤的發生、發展密切相關。Wang等[15]研究發現，胃癌組織中miR-218表達水平顯著低于癌旁組織，其低表達與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度及淋巴結是否轉移密切相關，miR-218低表達患者5年總生存率明顯低于高表達患者，可作為胃癌患者的預后生物標志物。Zhang等[16]研究發現，喉鱗狀細胞癌組織miR-218表達顯著低于相鄰正常組織，其過表達可顯著抑制喉鱗狀癌細胞的增殖和侵襲，是喉鱗狀細胞癌患者潛在的治療靶點。本研究結果顯示，喉癌組織中miR-218表達水平較對照組顯著降低，miR-218低表達與腫瘤直徑大小、TNM分期、分化程度和淋巴結轉移關系密切，提示miR-218表達在喉癌的發生發展過程中起重要作用。化療敏感的患者miR-218表達水平顯著高于化療不敏感患者，提示miR-218表達越高，對化療敏感性越強，療效越好。

準確預測miRNA的靶基因并正確認識 miRNA及其靶基因的相互作用是研究miRNA在疾病中作用機制的關鍵[17-20]。生物信息學分析發現，Survivin是miR-218的靶基因，miR-218可通過下調Survivin表達抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移等。農朝贊等[21]研究發現，轉染miR-218的人鼻咽癌CNE-2Z細胞增殖受到抑制，Survivin蛋白表達降低，miR-218可能通過下調Survivin表達誘導鼻咽癌細胞凋亡。萬軍等[12]研究發現，食管癌組織miR-218表達顯著降低，Survivin表達顯著升高，miR-218轉染人食管癌TE-1細胞后，可顯著降低細胞內Survivin mRNA和蛋白表達水平，提示食管癌中miR-218可能通過下調Survivin表達發揮抗腫瘤作用。Survivin是抗凋亡家族蛋白中抗凋亡作用最強的因子，可促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡、影響腫瘤血管生成等。Shi等[22]研究發現喉鱗狀細胞癌組織Survivin mRNA表達較癌旁組織顯著升高，Transwell侵襲實驗結果表明，過表達Survivin可顯著提高Hep-2細胞的相對存活率。Wen等[23]研究發現，轉染p-siRNA survivin后的喉癌Hep-2細胞增殖明顯受到抑制，抑制率高達79%，流式細胞術顯示Survivin沉默可顯著抑制體外和體內Hep-2的生長并誘導其凋亡。本研究結果顯示，喉癌組織中Survivin mRNA和蛋白表達水平均較對照組顯著升高，Survivin mRNA高表達患者腫瘤直徑大、TNM分期高、分化程度低及淋巴結發生轉移，提示Survivin參與喉癌的發生發展過程，是潛在的治療靶點。化療敏感的患者Survivin mRNA表達水平顯著低于化療不敏感患者，提示Survivin表達水平越低，對化療敏感性越強，療效越好。相關性分析結果顯示，喉癌組織miR-218和Survivin mRNA呈明顯負相關，提示喉癌組織中miR-218可能也通過下調Survivin表達抑制腫瘤的生長、侵襲和轉移。

表1 miR-218和Survivin mRNA表達與喉癌患者臨床病理特征關系

表2 miR-218和Survivin表達與化療敏感性分析 [例(%)]

綜上所述，喉癌組織中miR-218和Survivin均表達異常，與喉癌化療敏感性相關，可作為預測化療療效的生物學指標。喉癌組織中miR-218可能通過調控Survivin表達參與腫瘤發生和發展過程。但是，喉癌中miR-218具體如何調節Survivin表達發揮作用，調控的信號通路如何，還有待進一步深入研究。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

要兆旭：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；馮志星：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；彭麗娜、韓海平：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；赫莉：進行統計學分析；楊雪：課題設計，論文撰寫