淺談漆酶-介體系統在染料降解中的應用研究＊

劉友勛，張 坤，宋相儒，陳瑩瑩，黃 娟

（新鄉醫學院基礎醫學院，河南 新鄉 435003）

1 染料廢水的現狀

染料是指能在水溶液或在其他介質中，使纖維或其他基質染成各種鮮明而堅牢色澤的有機化合物。含染料廢水對環境有很大影響，極低濃度的染料排入受納水體就會造成強烈的視覺沖擊和美學損害，結構穩定的染料在環境中有較長的滯留期，會對人類健康造成嚴重的危害。而中國染料工業、紡織、印染業發達，含染料廢水排放量大、污染面廣，每年有超過1.6×109t的廢水未經任何處理而直接排入自然水體，給整個水生生態系統帶來破壞性后果。目前，對染料廢水的處理已成為中國廢水治理的一個焦點，但高效、低成本的處理技術還較少，因此，研究和發展新型、低成本和高效的去除染料污染物技術對保護環境和人類健康具有重要意義。

2 染料廢水不同處理方法

染料污染物去除的方法主要有物理法（吸附、膜技術等）、化學法（催化氧化法、電化學氧化法、臭氧氧化法等）及生物降解法（活性污泥、細菌、真菌及藻類等），這些傳統去除技術各有特點和缺點。相對于物理、化學處理方法，生物處理方法具有成本低、不產生二次污染等特點，因此，利用環境生物技術降解環境污染物日益引起人們的關注，尤其是生物酶催化技術。在眾多的生物酶中，對白腐菌產生的漆酶研究和應用最為廣泛[1]。

3 漆酶處理染料廢水的研究

漆酶是一種多銅離子蛋白，能催化多種酚類底物，以氧分子作為電子受體，產生的副產物只有水，對環境友好。由于漆酶的底物范圍很寬廣，能降解環境中多種有機污染物，在環境保護領域受到極大關注。真菌漆酶的氧化還原電位一般比較低（0.5～0.8 V），只能氧化降解氧化還原電勢低的酚類結構底物，而不能氧化降解氧化還原電勢高的非酚類底物。但研究發現在加入一些被稱為漆酶介體的小分子化合物后，能夠顯著促進漆酶對非酚類底物的催化作用，還能大大提高對酚類底物的催化效率，從而進一步擴大漆酶底物的范圍[2]。這些介體本身也是漆酶底物，起電子傳遞中間體的作用，使電子在酶和底物之間轉移。

目前，合成及天然的介體有100多種，研究表明，合成介體的效率要高于天然介體，其中最常用的合成介體是2，2-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）和 1-羥基苯并三唑（HBT）等[3]。各種來源的漆酶都可以快速地將ABTS氧化成ABTS+中間體，進而氧化底物。正是由于介體的發現，使得漆酶和其介體構成的催化系統（LMS）具有強大催化能力，并進一步促進了漆酶的廣泛使用，目前LMS在造紙工業、有機合成、生物傳感器和環境處理等多個領域有廣泛應用[4]。盡管以真菌漆酶為主的LMS系統有很強的催化能力和廣闊的應用前景，但對于LMS的大規模應用還存在一些問題：①漆酶受到環境因子影響，如高溫、強酸和強堿等可導致酶蛋白變性；②多數真菌漆酶的催化活性最適pH值在酸性范圍，在中性或堿性條件下則活性低或沒有活性；③可溶性小分子介體的二次污染和重復使用性；④由于漆酶分離和介體合成成本較高，直接導致LMS應用成本高而難以大規模應用。

采用一定載體以合適方式將酶固定化被認為是提高酶穩定性和解決酶重復使用的有效方法。酶固定方法有包埋法、結合法、吸附法及交聯法，固定化酶方法的選擇取決于載體性質、酶的種類、成本、使用目的和過程的復雜程度[5]。多數真菌漆酶的最適pH值在酸性范圍且不耐高溫，而挖掘新的漆酶資源是解決這一難題的有效途徑。近年來發現芽孢外衣殼蛋白（CοtA）具有多銅離子氧化酶的活性，能氧化多數真菌漆酶的典型底物如ABTS、丁香醛連氮和愈創木酚等，被認為是一種細菌漆酶[6]。更重要的是，這種細菌漆酶催化活性最適pH在中性或堿性，甚至在高堿性pH也保留較高的活性，同時在寬廣的pH范圍（4～11）內都能保持較高的穩定性，這表明細菌漆酶不僅能用于真菌漆酶不適用的堿性環境，還具有一定的酸堿耐受性[6]。溫度穩定性結果顯示，CοtA在80℃高溫能保持2 h的酶活性，證明CοtA也是一種熱穩定蛋白，這可能因為CοtA是一種芽孢外衣殼蛋白[6]。與真菌漆酶類似，細菌漆酶對環境污染物染料有一定的降解作用。細菌漆酶在環境處理應用中具有兩大優勢：①細菌漆酶具有較強的熱穩定性、酸堿耐受性，在中性或堿性有較好的活性；②細菌基因更易于克隆表達而有利于獲得大量基因工程化的酶，從而降低酶使用成本。

許多學者認為，細菌漆酶有可能取代真菌漆酶而應用于各種領域[6]。但細菌漆酶的氧化能力較真菌漆酶低，如何提高細菌漆酶催化能力是其應用中需要解決的問題。借鑒真菌漆酶的介體作用，可在細菌漆酶的催化反應中加入介體來提高其催化能力，然而有關細菌LMS的應用研究報道還較少。漆酶的大部分催化反應是在溶液中完成的，如果大量使用可溶性合成介體，由于合成介體具有潛在的環境毒性，其使用后難以回收，廢棄后會造成環境二次污染；如果催化反應完成后的介體能進行回收和重復使用，則這個問題迎刃而解。解決這一問題的一個思路是將介體小分子連接或吸附到固體材料中，使介體固定化，從而易于回收且能夠重復使用。固定介體的方法主要采取吸附和共價連接兩種方法，吸附方法雖然簡單但易導致介體的滲漏；采用共價連接方法，雖然復雜但可避免介體的滲漏。

4 共固定化LMS降解染料的研究

雖然LMS在環保等領域應用前景好，但可溶性的酶和介體分子使用后不易回收重復利用，導致其成本高，難以大規模應用。少數學者已考慮到將酶和介體進行共固定化[7]，如采用自由基聚合等方式使漆酶和介體共固定在一起，但SUN等報道采用自由基聚合的共固定化LMS凝膠需要較長的時間才能完成對孔雀綠染料的脫色作用[7]，這表明與自由酶和介體分子組成的LMS相比，這種共固定方式的LMS存在催化效率低的問題。其中一個原因可能是酶和介體共固定化之后，LMS和底物之間存在較大傳質阻力；另外一個原因是酶和介體被固定化后，彼此之間變成了剛性結構，導致介體不能像游離分子那樣進出酶活性中心，同時由于分子結構的變化導致介體和酶分子的催化活性中心契合程度減弱，介體分子傳遞電子的能力也大大降低，進而導致LMS催化效率降低。如何解決這些問題？我們以前的研究顯示，將介體（ABTS）共價修飾到氨基化SiO2納米粒子上，可有效利用SiO2納米和酶之間的良好生物相容性，同時在振蕩狀態下納米級別的顆粒對反應的過程中的傳質影響較小，可以大大改善固定化LMS催化效率[8]。根據前期的實驗結果，可以猜想到用于固定化中連接介體的“接頭分子”的結構類型和長度等會影響到介體分子與酶分子活性中心之間的作用，因此“接頭分子”結構對固定化LMS催化效率的影響有必要深入研究。另外，酶固定化后剛性結構也可能會影響酶和介體的結合，可以通過采用不同的酶固定化方式，盡量減少其不利影響。

5 結束語

漆酶是一種多銅離子蛋白，能催化多種酚類底物，以氧分子作為電子受體，產生的副產物只有水，對環境友好，在染料等污染物降解上有很大的應用前景。由漆酶組成漆酶-介體系統，可以有效解決因漆酶氧化還原電勢低造成的難題，加速對污染物的降解。雖然LMS在環保等領域應用前景廣泛，但可溶性的酶和介體分子使用后不易回收重復利用，導致其成本高，難以大規模應用。漆酶和介體進行共固定化是解決這個難題的重要途徑，但如何使二者有效地共固定還需要進一步研究。