腦栓通膠囊對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血脂水平的影響*

劉婷婷 孫芳玲 趙學(xué)慶 鄭文榮 田 欣 祝自新 郭德玉 王 文

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053)(2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081)

腦栓通膠囊由蒲黃、赤芍、郁金、漏蘆、天麻五味藥材組成，可以起到活血通絡(luò)、祛風(fēng)化痰的作用，是臨床治療缺血性中風(fēng)病常用的中成藥。君藥蒲黃活血化瘀、通達(dá)血脈；臣藥赤芍涼血行血、祛瘀破積；郁金行氣解郁，清氣化痰、解氣痰火郁遏；佐藥天麻熄風(fēng)止痙、通絡(luò)化痰；漏蘆清解郁熱、祛瘀通脈。臨床治療效果顯示其可以改善腦梗死患者運(yùn)動(dòng)功能，降低炎癥反應(yīng)，改善腦梗死患者腦血流儲(chǔ)備能力及血管彈性功能[1-6]，雖然腦栓通膠囊在臨床應(yīng)用過程中具有良好的治療效果，但是其治療作用的相關(guān)機(jī)制并不清楚，且少有相關(guān)的基礎(chǔ)理論研究報(bào)道。ApoE基因是一種負(fù)責(zé)包裝、運(yùn)輸和處理膽固醇與其他脂類的載脂蛋白，可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，維持膽固醇代謝平衡，是脂類代謝和心血管疾病的決定因子，缺乏ApoE會(huì)引起血漿內(nèi)富含膽固醇的物質(zhì)累積。ApoE基因敲除小鼠于1992年培育成功[7-8]。這種實(shí)驗(yàn)小鼠可以在正常或高脂飲食喂養(yǎng)的情況下，形成嚴(yán)重的高脂血癥并引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化病灶。ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化形成呈慢性、自發(fā)性、進(jìn)展性、連續(xù)性、廣泛性，在很大程度上與人類動(dòng)脈粥樣硬化形成相似，是探討動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的可靠模型[9]。本課題采用動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠模型，研究腦栓通膠囊對(duì)血脂水平的調(diào)節(jié)作用，探討腦栓通膠囊治療缺血性腦卒中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)別6周齡雄性ApoE-/-小鼠(品系：C57BL/6 J)，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部)提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2016-0010，合格證號(hào)NO.11804700015074，動(dòng)物使用許可證：SYXK(京)2015-0016。

1.2 藥物與試劑

腦栓通膠囊由廣東華南藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字Z20040093)。總膽固醇(TC)測(cè)試盒(A111-1)、甘油三酯(TG)測(cè)試盒(A110-1)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測(cè)試盒(A112-1)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)試盒(A113-1)購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器

全波長酶標(biāo)儀(Multiskan Spectrum，美國Thermo Fisher公司)。

1.4 方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：ApoE-/-小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，給予高脂飲食喂養(yǎng)(含0.15%膽固醇、21%脂肪)，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型[10-11]，在喂養(yǎng)過程中，隨機(jī)抽取小鼠，取其主動(dòng)脈弓，進(jìn)行油紅O染色，觀察有無斑塊形成的情況，判斷ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展程度確定造模是否成功。高脂飼料喂養(yǎng)12周后，隨機(jī)分為模型組、低劑量組和高劑量組，每組7只小鼠。低劑量組給予腦栓通膠囊0.5 g/kg體質(zhì)量，高劑量組給予腦栓通膠囊1.0 g/kg體質(zhì)量，對(duì)照組給予等量的蒸餾水，連續(xù)給藥12周，每天給藥1次。

1.4.2血樣采集及生化分析：小鼠用10%水合氯醛麻醉后，剪開下腹腔，暴露腹主動(dòng)脈，取血0.5～1.0 mL。室溫靜置2 h。放入離心機(jī)，3 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清，檢測(cè)TC、TG、HDL-C、LDL-C等生化指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 腦栓通膠囊對(duì)ApoE-/-小鼠總膽固醇含量的影響

總膽固醇是指血液中所有脂蛋白所含膽固醇的總和，是反應(yīng)血脂水平的重要指標(biāo)之一。結(jié)果顯示，與模型組比較，腦栓通小劑量組和腦栓通大劑量組的TC水平顯著降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,n=7)(圖1)。

圖1 腦栓通膠囊(NST)對(duì)ApoE-/-小鼠血清中總膽固醇含量的影響注：與模型組相比，**P<0.01Fig.1 Effect of Naoshuantong capsule (NST) on serum total cholesterol (TC) in ApoE-/- miceNote: compared with the model group,**P<0.01

2.2 腦栓通膠囊對(duì)ApoE-/-小鼠甘油三酯含量的影響

甘油三脂是長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人體含量最多的脂類，其水平高低與動(dòng)脈粥樣硬化程度密切相關(guān)[12]。根據(jù)血清生化分析結(jié)果顯示(圖2)，與模型組相比，腦栓通膠囊小劑量組和腦栓通膠囊大劑量組均能顯著降低血漿中的TG的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**P<0.01,n=7)。

圖2 腦栓通膠囊(NST)對(duì)ApoE-/-小鼠血清中甘油三酯含量的影響注：與模型組相比，**P<0.01Fig.2 Effect of Naoshuantong capsule (NST) on serum triglyceride (TG) in ApoE-/- miceNote: compared with the model group,**P<0.01

2.3 腦栓通膠囊對(duì)ApoE-/-小鼠低密度脂蛋白膽固醇含量的影響

低密度脂蛋白膽固醇高于正常水平時(shí)，易聚集于大中動(dòng)脈分支及彎曲處，與動(dòng)脈粥樣硬化的生成有直接關(guān)系[13]。與模型組比較，腦栓通膠囊小劑量組LDL-C水平顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(**P<0.01，n=7)；腦栓通膠囊大劑量組LDL-C水平顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(***P<0.001，n=7)(圖3)。

圖3 腦栓通膠囊(NST)對(duì)ApoE-/-小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇含量的影響注：與模型組相比，**P<0.01，***P<0.001Fig.3 Effect of Naoshuantong capsule (NST) on serum low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) in ApoE-/- miceNote: compared with the model group,**P<0.01,***P<0.001

2.4 腦栓通膠囊對(duì)ApoE-/-小鼠高密度脂蛋白膽固醇含量的影響

高密度脂蛋白膽固醇是一種抗動(dòng)脈粥樣硬化的脂蛋白，可將膽固醇從肝外組織轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)行代謝，由膽汁排出體外[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖4)，與模型組比較，腦栓通膠囊小劑量組和腦栓通膠囊大劑量組的血清HDL-C水平?jīng)]有明顯差異(P>0.05,n=7)。

圖4 腦栓通膠囊對(duì)ApoE-/-小鼠血清高密度脂蛋白膽固醇含量的影響Fig.4 Effect of Naoshuantong capsule (NST) on serum high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C) in ApoE-/- mice

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是腦卒中及外周血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，而脂質(zhì)代謝紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)重要因素。高血脂癥中大量脂質(zhì)進(jìn)入血管內(nèi)膜下引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血漿脂蛋白進(jìn)入血管內(nèi)膜，引起巨噬細(xì)胞吞噬反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞增生，形成斑塊，斑塊堵塞腦血管，則引發(fā)腦卒中[15]。腦栓通膠囊是臨床用于治療腦卒中的中藥復(fù)方制劑，且療效顯著，但其具體的作用機(jī)理并不清楚。ApoE蛋白是清除乳糜微粒和極低密度脂蛋白受體的配體。存在于多種脂蛋白顆粒中，可運(yùn)載內(nèi)源性和外源性膽固醇，在動(dòng)脈粥樣硬化中起保護(hù)作用，因此缺乏ApoE則導(dǎo)致血液循環(huán)中富含膽固醇的物質(zhì)積累，形成動(dòng)脈粥樣硬化。ApoE基因缺陷小鼠是由美國洛克菲大學(xué)和北卡羅萊那大學(xué)兩處實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用胚胎干細(xì)胞基因敲除技術(shù)，于1992年培育成功[7-8]。因?yàn)樵撔∈竽茉谧匀伙嬍硹l件下形成動(dòng)脈粥樣硬化，并且其病理改變與人類極為相似，甚至能形成纖維斑塊，廣泛地用于動(dòng)脈粥樣硬化的藥效與機(jī)制研究[16-17]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠血脂水平的檢測(cè)，探討腦栓通治療腦卒中的相關(guān)機(jī)制。TC是指血液中各脂蛋白所含膽固醇的總和，結(jié)果顯示，腦栓通膠囊小劑量組和腦栓通膠囊大劑量組均可降低TC含量。低密度脂蛋白以膽固醇為內(nèi)核，含4 536個(gè)氨基酸殘基的載脂蛋白B100覆蓋于表面，借助非極性的疏水基團(tuán)與內(nèi)核相連。當(dāng)血漿LDL水平高于正常時(shí)會(huì)集聚于大中動(dòng)脈分支彎曲處，進(jìn)入損傷血管內(nèi)膜，氧化生成Ox-LDL。Ox-LDL可對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性造成破壞，促進(jìn)動(dòng)脈內(nèi)膜的脂質(zhì)沉淀，是動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵啟動(dòng)因素[18-20]。研究結(jié)果顯示，腦栓通小劑量組和腦栓通大劑量組可以顯著降低LDL-C的水平。此后，研究人員又進(jìn)一步觀察了腦栓通膠囊對(duì)HDL-C的調(diào)節(jié)作用。HDL-C參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，將巨噬細(xì)胞、血管平滑肌等肝外組織細(xì)胞內(nèi)膽固醇攜帶至肝臟轉(zhuǎn)化為膽汁酸或直接通過膽汁酸排出體外，從而減輕整體的脂質(zhì)負(fù)荷[13, 21]，所以普遍認(rèn)為HDL-C具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。但HDL-C具有雙重作用，其在生理狀態(tài)下，HDL的抗動(dòng)脈粥樣硬化功能占優(yōu)勢(shì)，處于主導(dǎo)地位。而在病理狀態(tài)下，HDL-C的結(jié)構(gòu)成分會(huì)發(fā)生病理變化，其理化性質(zhì)及功能狀況相應(yīng)改變，使HDL-C抗動(dòng)脈粥樣硬化作用減弱甚至逆轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，腦栓通膠囊給藥組的HDL-C水平?jīng)]有顯著增加或減少，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示腦栓通膠囊用于治療動(dòng)脈粥樣硬化過程中可能和HDL-C水平無關(guān)。TG是血漿中各脂蛋白所含脂肪的總和，其升高時(shí)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白活性增加，促進(jìn)TG含量在HDL及LDL中表達(dá)增加，HDL和LDL中的TG會(huì)被肝脂酶和脂蛋白脂酶進(jìn)一步水解形成小而致密的HDL和LDL顆粒，LDL顆粒則在血管壁沉積，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[22]。研究結(jié)果顯示，腦栓通膠囊小劑量組和大劑量組均可顯著降低TG的水平。

綜上所述，腦栓通膠囊可以顯著降低總膽固醇、低密度脂蛋白及甘油三脂的水平，從而減少動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，提示該途徑可能是腦栓通膠囊治療腦卒中的作用機(jī)制之一。