不同小鼠肝炎病毒對ELISA方法檢測其血清抗體的影響*

吳朋朋 白 冰 張彩勤 趙 勇 苗海港 師長宏

(空軍軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

小鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV)是國家標準(GB14922.2—2011)中規定的實驗用鼠病毒學重要檢測項目。MHV具有高度傳染性，但在鼠群中通常以潛伏性感染存在，并可通過胎盤垂直傳播。當感染小鼠群免疫功能下降時，即可能引起整個鼠群爆發性的急性感染，導致動物大量死亡，嚴重影響實驗動物的生產和動物實驗的結果[1]。除此之外，小鼠肝炎病毒感染后會引起小鼠各種免疫應答參數的改變，干擾試驗結果，影響研究結果的準確性和可靠性[2-3]。

國家標準(GB14922.2—2011)規定實驗用小鼠每3個月至少進行一次微生物檢測，故MHV血清抗體的檢測是實驗用小鼠質量控制的重要舉措[4-5]。然而，現今已分離到的MHV病毒株有MHV1、MHV2、MHV3、JHM、A59、MHV-S、MHV-Z、MHV-U等[6]，不同的MHV毒株因其嗜組織性不同具有不同的致病性，如JHM為嗜神經毒性，MHV3為嗜肝性，A59同時具有嗜神經毒性和嗜肝性兩種特性[7-8]。由于MHV有多個毒株，在研制ELISA抗體檢測試劑盒時，選用哪些毒株作為檢測用的抗原，將直接影響到血清抗體檢測結果的特異性和敏感性。各國及各地區MHV流行情況不一樣，所選用的毒株也各不相同[9]。國家標準(GB/T14926.22—2001)規定了MHV1、MHV3、JHM和A59 4種病毒作為MHV抗體檢測的抗原[10]。

本實驗室每季度都會對本地區飼養的實驗小鼠進行病毒檢測，采用的方法是ELISA監測(GB/T14926.50—2001)、免疫熒光復檢(GB/T14926.52—2001)和核酸測序確診[11]。其中MHV抗體水平檢測采用的是國內生產的ELISA檢測試劑盒。使用中發現ELISA抗體檢測結果和IFA抗體檢測結果存在一定差異，具體表現在：當血清抗體水平處于判定臨界值左右時(0.15～0.22)，ELISA抗體檢測陰性結果在IFA復檢時存在29.7%的陽性結果(11/37)，病毒核酸測序結果也提示本地區的MHV流行毒株與ELISA抗原包被的MHV病毒株有所不同。為了獲得適合本地區MHV抗體檢測的ELISA方法，本研究選取了3種MHV毒株MHV1、JHM和A59，通過L929細胞擴增培養獲得純化濃縮抗原，篩選獲得了適合本地區的包被抗原類型，優化了ELISA反應體系，建立了規范化的MHV血清抗體檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞及實驗動物等實驗材料來源

小鼠肝炎病毒MHV1(ATCC VR-261)、MHV-JHM(ATCC VR-765)、MHV-A59(ATCC VR-764)購于美國模式培養物集存庫(ATCC)；細胞L929購于國家實驗細胞資源共享平臺；DMEM細胞培養基及其他添加劑均為Hyclone公司產品；小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠仙臺病毒(SV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、呼腸孤病毒III型(Reo3)、小鼠細小病毒(MVM)和鼠痘病毒(Ect)陽性血清購于中國食品藥品檢定研究院；HRP-羊抗鼠IgG酶標抗體購買于Abcam公司；酶標儀購于Bio-rad公司；超速離心機購于Beckman公司；商品化MHV抗體ELISA診斷試劑盒購買于國內某公司；165份小鼠血清由本實驗室保存。

SPF級BALB/C小鼠30只，6～8周齡，體質量25～27 g，購于北京維通達生物技術有限公司[SCXK(京)2014-001]，隔離飼養于空軍軍醫大學實驗動物中心SPF級動物設施[SYXK(陜)2014-001]，動物實驗通過了空軍軍醫大學實驗動物福利及倫理委員會批準(編號17034)。

1.2 病毒的擴增及純化

將購買的3株小鼠肝炎病毒MHV-A59、MHV1和MHV-JHM冰上融化后分別用無血清DMEM培養基稀釋(0、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40)后接種到培養成單層的L929細胞中，同時以無血清DMEM培養基作為陰性對照孔，在37 ℃、5%的CO2培養箱中孵育3 h(每30 min搖晃一下細胞)，孵育結束后棄掉病毒孵育液補加適量的完全細胞培養液(含10%胎牛血清)繼續于37 ℃、5%的CO2培養箱中，培養至出現明顯的細胞病變。

將出現病變的細胞培養物反復凍融5次，每組取少量病毒凍融液用于病毒滴度測定，其余凍融液經56 ℃ 30 min滅活處理后，5 000 r/min離心30 min，除去細胞碎片，收集上清病毒液再4 ℃超速離心(25 000 r/min，82 700 g)3 h以濃縮病毒，將濃縮后的病毒液作為抗原用于后期的ELISA檢測板包被[12]。

1.3 病毒滴度(TCID50)測定

將擴增后的病毒液10倍梯度稀釋(10-1～10-8共8個梯度)后接種到L929細胞中，每個梯度8個重復，72 h后觀察細胞病變情況，按照Reed-Muench法計算病毒滴度[13]。

1.4 血清的制備

陽性對照血清制備：取滅活的3種MHV病毒等體積混合液接種6～8周齡SPF級BALB/C小鼠30只，免疫程序參考侯麗波等[14]方法，接種方法如下：第1天完全佐劑+病毒液(50 μg)每只小鼠肌肉注射0.1 mL，腹腔注射0.2 mL；第14天不完全佐劑+病毒液(50 μg)每只小鼠肌肉注射0.1 mL，腹腔注射0.2 mL；第21天不完全佐劑+病毒液(50 μg)每只小鼠肌肉注射0.1 mL，腹腔注射0.2 mL；第28天不完全佐劑+病毒液(50 μg)每只小鼠肌肉注射0.1 mL，腹腔注射0.2 mL。分別于免疫后第1、3、5、7、14、21、28、35、42天采血測定MHV抗體，確定最佳采血時間。抗體△A值介于1.0～1.5之間的稀釋血清均可作為后續ELISA檢測的陽性對照血清。

陰性對照血清制備：收集排除MHV感染的SPF級BALB/C小鼠血清，經MHV抗體檢測抗體△A值小于0.2的稀釋血清均可作為后續ELISA檢測的陰性對照血清。

165份待檢血清制備：采取待檢小鼠的血液500 μL以上，室溫靜置后離心分離血清，儲藏在-80 ℃冰箱中備用。

1.5 ELISA反應體系的優化

用不同稀釋倍數的病毒濃縮液包被ELISA酶標板，測定梯度稀釋的免疫血清和標準對照血清的A值，挑選出最為合適的病毒包被濃度、封閉液濃度以及血清稀釋倍數，并比較在不同的反應條件下免疫血清檢測結果的差異，確定適合本實驗室的最佳反應條件。

1.6 血清樣品的檢測及判定標準的確定

按照優化的最佳ELISA反應條件與步驟，隨機選取50份已知抗體濃度的免疫血清，用本研究制備的診斷試劑盒進行抗體濃度的測定，取波長492 nm和405 nm，讀取各孔A值，結果以A492減A405(△A)表示。

結果判定：陽性對照△A值≥0.2，陰性對照△A值<0.2，同時滿足以上兩個條件實驗成立；否則不成立。

以已知陽性臨界血清測量值為參考，計算出陰性血清樣品平均△A值和標準差SD，且每份陰性樣品△A值是通過3次ELISA測定求的平均值，進而計算出陽性判定臨界值(cut-off value)：臨界值=陰性樣品的平均△A值+3SD。

1.7 檢測體系的質量控制

特異性試驗：按照優化好的最適ELISA反應條件與步驟，用本試劑盒分別檢測MHV、SV、PVM、Reo3、MVM和Ect陽性血清，每個樣品重復檢測3次，同時做陰性和陽性對照孔，分別計算每份血清的△A均值，從而確定本試劑盒的特異性。

重復性試驗：用本試劑盒在相同的試驗條件下，將5份ELISA陽性樣品，2份ELISA陰性樣品，每個樣品重復檢測3次，分別計算每份血清的△A均值(average value，AV)、標準差(standard deviation，SD)、變異系數(the coefficient of variation，CV)。同時用不同批次包被的酶標板進行批次間重復性檢驗。

穩定性試驗：為評價所建立的ELISA檢測方法的穩定性，將包被好的ELISA酶標板分別置于37 ℃、25 ℃、4℃環境，每天取出1塊，連續測定7 d，觀察陽性血清樣品和陰性血清樣品的△A值的變化。

靈敏度試驗：將MHV陽性血清做倍比稀釋，檢測本研究制備的試劑盒所能檢測出的最低抗體滴度。

1.8 性能評價與初步應用

用本研究制備的ELISA診斷試劑盒與商品化MHV ELISA試劑盒平行檢測165份小鼠血清樣品，評價本研究制備的試劑盒與商品化試劑盒的檢測結果符合率。

1.9 統計方法

所有計量數據以平均數表示，應用SPSS19.0統計學軟件對各項指標數據進行統計學分析，應用配對t檢驗對組間進行分析比較，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 病毒的擴增及病毒滴度的測定

L929細胞感染MHV-JHM病毒株36 h即可觀察到細胞病變，48～60 h病變最為明顯，72 h后細胞逐漸崩解；MHV-A59和MHV1毒株則于感染48 h以后出現細胞病變，病變明顯時間段為60～72 h，隨后細胞逐漸崩解(圖1)，分別在感染96 h后收取3種病毒的細胞培養物進行病毒滴度測定(圖2)，發現3種病毒的最佳接種濃度(病毒稀釋倍數)均不相同，MHV1(1∶5稀釋)、MHV-A59(1∶10稀釋)、MHV-JHM(1∶20稀釋)。病毒培養物經56 ℃ 30 min滅活處理后，5 000 r/min離心30 min除去細胞碎片，收集上清病毒液再經4 ℃超速離心(25 000 r/min，82 700 g)3 h濃縮病毒，將濃縮后的病毒液作為抗原用于后期的酶標板包被。

圖1 不同MHV感染L929細胞出現的細胞病變(72 h，×10)注：A：MHV-A59；B：MHV1；C：MHV-JHM；D：L929細胞Fig.1 The cytopathic effect inoculated with L929 in 72 hourNote：A：MHV-A59；B：MHV1；C：MHV-JHM；D：L929

圖2 不同稀釋倍數MHV感染L929細胞96 h病毒滴度Fig.2 L929 cells were infected with different dilutions of MHV at 96 h

2.2 陽性標準血清的制備

如圖3所示，BALB/C小鼠感染MHV后，第3天即可檢測到抗體水平，5～7 d抗體水平開始快速升高，21 d左右抗體水平的△A值達到1.0以上，在35 d達到最高峰并維持一段時間，因此可于免疫后35 d采取全部小鼠血清，MHV抗體滴度(△A)介于1.0～1.5之間的稀釋血清均可作為后續ELISA檢測的陽性對照血清。

圖3 MHV免疫BALB/C小鼠血清MHV抗體變化Fig.3 The antibody variation of SPF mice(BALB/C)inoculated with MHV

2.3 ELISA反應體系的優化

2.3.1病毒類型及包被濃度：分別用滅活的3種小鼠肝炎病毒MHV-A59、MHV1和MHV-JHM病毒包被ELISA酶標板孔，測定已知濃度的免疫陽性血清和標準血清的△A值，每組3個重復，以△A值最大為最優的包被病毒，結果如圖4所示，MHV1包被的ELISA酶標板測定的血清濃度更為接近商品化試劑盒，與A59和JHM包被的ELISA酶標板測定的血清濃度差異顯著(P<0.05)。

圖4 不同MHV測定小鼠血清MHV抗體注：C1-C6：C57BL/6J小鼠血清；B1-B4：BALB/C小鼠血清；K2：昆明小鼠血清；Positive：MHV陽性血清； Negative：MHV陰性血清；BLANK:空白對照Fig.4 The MHV antibody of mice test with different MHVNote：C1-C6：C57BL/6J；B1-B4：BALB/C；K2：Kunming；Positive：MHV antibody positive serum sample； Negative：MHV antibody negative serum sample；BLANK: MHV antigen-free control

MHV1病毒濃縮液用包被緩沖液稀釋為不同濃度(0、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40)包被ELISA酶標板孔，測定已知濃度的免疫陽性血清和標準血清的△A值，每組3個重復，以△A值最大為最優的病毒包被濃度。結果顯示，1∶10倍稀釋的MHV1包被的ELISA酶標板測定的血清濃度更為接近商品化試劑盒，與其他稀釋倍數組(0、1∶5、1∶20、1∶40)包被的ELISA酶標板測定的血清濃度差異顯著(P<0.05)。故本實驗采用1∶10倍的病毒稀釋濃度為最優的病毒包被濃度(即病毒包被濃度為10-7.73/0.1 mL TCID50，抗原蛋白濃度為4.0 μg/mL)。

2.3.2待檢血清工作濃度的優化：將待檢血清做0、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀釋，同時設3個陰性和陽性對照(不稀釋)，每組3個重復，100 μL/孔，孵育時間均為60 min，測定不同稀釋濃度的待檢血清的△A值，以△A值最大為待檢血清工作濃度。結果顯示，1∶40倍稀釋血清的濃度更為接近商品化試劑盒，與其它血清稀釋組(0、1∶10、1∶20、1∶80、1∶160)測定的結果差異顯著(P<0.05)，故本實驗采用1∶40稀釋的待檢血清濃度為最優待檢血清濃度。

2.3.3HRP-羊抗鼠酶標抗體工作濃度的優化：將HRP-羊抗鼠酶標抗體1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000稀釋，100 μL/孔，每組3個重復，測定待檢血清的△A值，以△A值最大為酶標抗體工作濃度，孵育時間均為1 h。結果顯示，隨著HRP-羊抗鼠酶標抗體濃度降低，各組抗體滴度呈緩慢下降的趨勢，1∶4 000稀釋的酶標抗體測定的血清濃度更為接近商品化試劑盒，故本實驗采用1∶4 000酶標抗體稀釋濃度為最優酶標抗體濃度。

2.3.4顯色時間的優化：每孔加100 μL配好的OPD顯色液[0.2 mol/L Na2HPO42.57 mL，0.1 mol/L檸檬酸2.43 mL，蒸餾水5 mL，鄰苯二胺(OPD)4 mg，3%H2O2150 μL]，37 ℃顯色時間分別設為10 min、20 min、40 min、60 min和90 min，每組設3個重復，顯色結束后加入50 μL終止液(0.5 mol/L H2SO4)終止反應；取波長492 nm和405 nm，讀取各孔A值，結果以A492減A405(△A)表示，以△A值最大為最佳顯色時間。結果顯示，顯色10 min內，血清抗體呈現顯著升高的趨勢，隨后抗體增長平緩，各顯色時間組之間無顯著差異(P>0.05)，因此本實驗采用的最優顯色時間為10 min。

綜上所述，適合本實驗室的最佳ELISA反應條件及步驟如下：

濃縮后的病毒液用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至抗原蛋白濃度為4.0 μg/mL，每孔加100 μL，4 ℃包被過夜，同時做只加包被液的孔作為空白對照；棄去病毒液，每孔加入250 μL封閉液(pH 9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液含2.0% BSA)，4 ℃孵育過夜；將待檢血清做1∶40倍稀釋，每孔100 μL，振蕩混勻，37 ℃孵育1 h；PBST(pH 7.4)重復洗滌5次后甩干液體；每孔加入100 μL HRP標記的羊抗鼠酶標抗體(1∶4 000稀釋)，37 ℃孵育1 h；棄去孔內液體，重復上述洗滌步驟；每孔加100 μL OPD顯色液顯色10 min，加入50 μL終止液；取波長492 nm和405 nm，讀取各孔A值，結果以A492減A405(△A)表示。

2.4 血清樣品的檢測及判定標準的確定

使用本研究制備的診斷試劑，按照優化好的ELISA反應條件與步驟，隨機選取本實驗室保存的小鼠血清165份，用于進行抗體濃度的測定，同時用商品化試劑盒測定的血清抗體濃度作為對照。陽性對照△A值≥0.2，陰性對照△A值<0.2，同時滿足以上兩個條件則實驗成立；否則不成立。以已知陽性臨界血清測量值為參考，計算出陰性血清樣品平均△A值和標準差SD，且每份陰性樣品△A值是通過三次ELISA測定求的平均值，進而計算出陽性判定臨界值(cut-off value)：臨界值=陰性樣品的平均△A值+3SD。結果如表1所示。

表1 小鼠MHV血清抗體檢測Table 1 MHV antibody of mouse serum

2.5 檢測體系的質量控制

使用本研究制備的診斷試劑，按照優化好的ELISA反應條件與步驟，分別檢測MHV、SV、PVM、Reo3、MVM和Ect陽性血清，每個樣品重復檢測3次，同時做陰性和陽性對照孔，分別計算每份血清的△A均值，從而確定本試劑盒的特異性。結果如表2所示，只有MHV陽性血清的△A值遠大于0.22判定為陽性，ECT和SV陽性血清△A值雖處于可疑值范圍之內，考慮的陰性血清△A值較高(>0.1)，可視為血清非特異性結合，PVM、Reo3、MVM陽性血清△A值均低于0.17，判定為陰性，表明該方法具有良好的特異性。

表2 特異性檢測Table 2 Specific tests

重復性試驗：用本試劑盒將5份MHV陽性樣品，2份MHV陰性樣品，每個樣品重復檢測3次，分別計算每份血清的△A均值(average value，AV)、標準差(standard deviation，SD)、變異系數(the coefficient of variation，CV)。結果如表3所示，各組血清的重復性均良好(CV值<10%)。

表3 批次內重復性檢測Table 3 Batch of repeatability tests

同時用不同批次包被的酶標板進行批次間重復性檢驗，結果如表4所示，陰性血清變異系數偏大(10%)，但也在酶標儀測定誤差范圍之內，其余各組血清的重復性均良好(CV值<10%)。

表4 批次間重復性檢測Table 4 Batch to batch repeatability tests

穩定性試驗：為評價所建立的ELISA檢測方法的穩定性，將包被好的ELISA酶標板分別置于37 ℃、25 ℃、4℃環境，每天取出1塊，連續測定7 d，觀察其在405 nm和492 nm波長處其△A值的變化。結果如表5所示，孵育環境(37 ℃)和室溫環境(25 ℃)，無論是樣品血清(B3)還是陰陽性對照血清，隨著時間的延長(7 d)，MHV血清抗體水平呈緩慢下降的趨勢且批次間△A值變異系數偏大(>10%)，不適合試劑盒的長期儲存；冷藏環境下(4 ℃)，MHV血清抗體水平各批次間△A值變異系數最小(<10%)，適合于長期儲存。

表5 穩定性檢測Table 5 stability tests

靈敏度試驗：將MHV陽性血清做倍比稀釋，檢測本研究制備的試劑盒所能檢測出的最低檢出量。結果如表6所示，陽性對照(2.113)在稀釋倍數大于1∶4 000時△A值小于0.22，臨床陽性血清B3(0.603)則在稀釋倍數大于1∶1 000時△A值小于0.22，具有一定的靈敏性，這與臨床血清本身MHV抗體水平偏低有關。

表6 靈敏性檢測Table 6 Sensitivity tests

2.6 性能評價與初步應用

用本研究制備的ELISA診斷試劑盒與商品化MHV ELISA試劑盒平行檢測165份小鼠血清樣品，評價本研究制備的試劑盒與商品化試劑盒的符合率。陰陽性判定結果如表1所示，陰性樣品符合率為92.91%(118/127)，陽性樣品符合率為97.37%(37/38)不符合樣品為10份，主要分布在鄰近商品化試劑盒判定標準附近的血清(0.15～0.22)，需進一步復檢，兩次結果均為可疑則可判定為陽性。

3 討論

由于MHV有多個毒株亞型，且不同地區之間MHV流行情況不一樣，所選用的毒株也各不相同。在研制試劑盒時，選用哪些毒株作為檢測用的抗原將直接影響到檢測結果的特異性和敏感性，需要根據不同組織型的MHV選擇不同的包被抗原進行檢測[15]。在實際應用中通常需要用不同的診斷試劑對同一份樣品反復進行驗證，才能確定其準確結果。或者采用同時包被多種抗原類型來達到一次操作能夠檢測多種病毒的目的，但由于不同抗原之間的干擾及各地區實際感染現狀的差異，結果準確性較單一抗原有所降低，容易造成誤判，使整個實驗動物群體存在隱形感染MHV的風險[16-17]。為此，在全面對本地區實驗小鼠進行流行病學性調查的基礎上，我們從美國ATCC購買了我國主要流行的3株小鼠肝炎病毒MHV1(ATCC VR-261)、MHV-JHM(ATCC VR-765)、MHV-A59(ATCC VR-764)作為不同的ELISA包被抗原，用于本地小鼠MHV陽性臨床血清抗體的檢測。

在用L929細胞進行病毒擴增培養時我們發現，L929細胞感染MHV-JHM病毒株36 h即可觀察到細胞病變，48～60 h病變最為明顯，72 h后細胞逐漸崩解；MHV-A59和MHV1毒株則于感染48 h以后出現細胞病變，病變明顯時間段為60～72 h，隨后細胞逐漸崩解(見圖1)，分別在感染96 h后收取3種病毒的細胞培養物進行病毒滴度測定(圖2)，發現3種病毒的最佳接種濃度(病毒稀釋倍數)均不相同，MHV1(1∶5稀釋)、MHV-A59(1∶10稀釋)、MHV-JHM(1∶20稀釋)，這說明病毒的擴增有一定的濃度要求。選取最佳接種劑量的小鼠肝炎病毒可以在感染細胞2～3 d的時間內出現病毒的快速增長，病毒的培養較為穩定，在接種后72 h收獲病毒，符合試劑盒病毒生產的需要。

研究表明MHV-A59與其它毒株之間有交叉反應，是一個有廣泛反應性的抗原，曾作為ELISA檢測的包被抗原，我國MHV抗體酶標檢測試劑盒主要使用三價抗原，結合模式一般為經典毒株與新分離毒株相結合的組合，檢出率也明顯高于單抗原，陽性率的差別主要表現在對弱陽性樣品或不確定樣品的陽性檢出率上[18-21]。本研究用不同MHV病毒株抗原包被，檢測本地小鼠MHV陽性臨床血清抗體，結果發現相比于商品化試劑盒測定的血清抗體濃度，MHV1抗原包被的ELISA酶標板測定的血清陽性檢出率更為接近商品化試劑盒，與A59和JHM包被的ELISA酶標板測定的結果差異顯著(P<0.05)，MHV-A59檢測結果只有參考值的一半，MHV-JHM無論陰陽性血清均無明顯反應，這說明本地小鼠MHV陽性臨床血清主要是MHV1和MHV-A59感染引起，這與前期的病毒核酸測序鑒定結果相符。另一方面，該商品化試劑盒的參考陽性血清檢測結果MHV-A59和MHV-JHM抗體水平最高，反而MHV1的檢測結果最低，這說明該試劑盒抗原包被時雖然都含有以上3種病毒類型，但以MHV-A59和MHV-JHM病毒為主，MHV1次之，這與本地區流行的病毒株有很大的出入，也可能是該試劑盒在使用過程中ELISA抗體檢測結果和IFA抗體檢測結果有著一定的差異的原因之一。

隨后，本研究選取了MHV1作為適合本地區的包被抗原類型并優化ELISA反應體系，以期獲得一種穩定、精密、檢測準確的MHV血清抗體ELISA診斷方法，可以用于MHV的日常病原學監測。通過對大量臨床小鼠血清樣本(165)的測試，小鼠的MHV陰性血清檢測數據多控制在0.07左右，而不同實驗條件對此標準會有一定影響，例如顯色時間和顯色液類型，因此我們采取陰性參比血清的檢測結果加2SD(陰性ΔA+2SD，0.17)作為陰性判定標準。以此標準對大量樣品做多次檢測，檢測的準確性達到92.91%(118/127)，因此在檢測過程中低于此標準的樣品可做陰性判定。而高于此標準的血清樣品，仍有少量不能用IFA和Western blot等方法做陽性判定，因此在本試劑盒中增設了陽性臨界濃度血清判定指標陰性ΔA+3SD(0.22)，當ELISA檢測結果高于此標準時，使用IFA和Western blot等方法可對此樣品做出一致的判斷。而低于此標準高于陰性判定標準的樣品(0.15～0.22)，其來源動物的種群需要做進一步的檢測來確認。