長期精神緊張建立抑郁癥模型*

龔 宇 徐騰鶴 錢婷婷 羅 穎 陳 浩 趙麗君 吳曉光

(1.承德醫學院,承德 067000)(2.承德醫學院基礎醫學研究所，承德 067000)

近年來抑郁癥的發病率逐年增高。據世界衛生組織最新統計，抑郁癥影響到全球約20%的人群，預計到2020 年，抑郁癥將在醫療疾患排名中居第2位[1]。抑郁癥的發病機制十分復雜，目前的研究未能完全闡明疾病的病因，為特效藥物研發和臨床治療造成了極大的難度[2]。抑郁癥動物模型制作若能相對簡單方便、成熟穩定，對于研究其致病機制和開發抗抑郁藥物具有重要的作用。目前關于抑郁癥動物模型有許多種，如習得性無助、慢性不可預見性刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)、母嬰分離、社會挫敗等[3]，多采用長期不可預見、輕度的應激以模擬人在生活中經歷的負性生活事件進行造模。許多臨床調查表明[4]，長期經歷負性事件是導致抑郁癥的主要危險因素之一。現代人們在面對著逐步加快的生活節奏和日趨激烈的社會競爭時，長期的精神高度緊張成為常態，而這可能是抑郁癥發病的重要原因之一。本模型采用長期驚嚇和睡眠剝奪使小鼠長期處于精神緊張狀態，造模后進行抑郁行為學測試，探究長期精神緊張與抑郁癥的關系，為開展有關抑郁癥的發病機制及藥物研發提供動物模型基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6 J雄鼠小鼠(4周齡)17只，SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號: SCXK(京)2014-0004。飼養于清潔級環境，實驗期間所有小鼠均可以自由飲水、攝食，明暗周期為12 h/12 h(8: 00—20: 00)，室溫21～23 ℃，濕度50%～55%。適應性飼養1周。

1.2 儀器

小動物運動軌跡跟蹤系統(購自上海欣軟信息科技有限公司)。曠場行為測試箱，自制(長×寬×高為50 cm×50 cm×30 cm)。睡眠剝奪箱，自制(長×寬×高為60 cm×40 cm×30 cm)，中央固定一直徑30 mm平臺。

1.3 模型建立

將17只雄性小鼠隨機分為對照組7只、長期精神緊張刺激(LTMS)組10只。LTMS組單籠飼養。對照組7只一籠飼養，正常飼養，每周測定攝食量，刺激實驗之后進行行為學實驗。對LTMS組小鼠采用每天隨機時間進行貓驚嚇3 h、睡眠剝奪12 h兩種刺激，連續21 d。睡眠剝奪箱使用60 cm×40 cm×30 cm水箱，水面深度足夠淹沒小鼠，在中央放置直徑30 mm圓臺并高出水面0.5 cm，在水箱上方放置有鼠糧的鐵網，以確保小鼠的食物供給。貓嚇操作在直徑1.2米的曠場中，將裝有單只小鼠的鐵籠放在中央，吸引貓對小鼠驚嚇，為確保貓在長期實驗中的興趣，實驗前禁食并不定期給予活鼠獎勵。

1.4 行為學評價

1.4.1攝食量測定：參考湯球等[5]操作方法，分別于刺激的第0天、第7天、第14天、第21天早上8:00給小鼠添加食物50 g，次日早上8:00稱取每只小鼠的食物殘余量，計算其24 h攝食量。同時對小鼠稱質量，以24 h內消耗食物量(mg)/體質量(g)作為食物消耗量。同籠的小鼠要分開孤籠測量。

1.4.2曠場實驗：用曠場實驗(open field test,OFT)檢測小鼠活動度和對陌生環境探索的行為程度，水平和垂直運動的次數是曠場實驗主要觀察指標[6]。刺激造模21 d之后在安靜、適宜小鼠的環境中，將小鼠放置于曠場敞箱(50 cm×50 cm×30 cm)底面中心，箱壁四周及底面為白色。底面劃分為9個等邊方格。曠場觀察實驗時間為5 min。將小鼠放入中心方格內，攝像記錄5 min內穿越格數(以重心越過為準)，記錄小鼠在曠場中的運動路程、穿越格數(水平活動得分)和前肢均離地或攀壁的直立次數(垂直活動得分)。每次實驗后用75%酒精對曠場裝置進行清理，消除異味。

1.4.3高架十字迷宮實驗：高架十字迷宮由開放臂(30 cm×5 cm)、閉合臂(30 cm×5 cm×15 cm)和兩臂匯合的中央區(5 cm×5 cm)組成，距地面50 cm。根據實驗[7]，于模型刺激21 d測試，將小鼠放在中央區，面對開臂方向，觀察動物在開臂和閉臂中的活動情況[8]，實驗在暗光、安靜下進行，觀察5 min，記錄小鼠進入開放臂次數、開放臂停留時間、進入閉合臂次數和閉合臂停留時間。

1.4.4強迫游泳實驗：強迫游泳實驗主要記錄小鼠在水中放棄掙扎不動的時間，可以較好反映其低落情緒和絕望狀態[6]。參考Porsolt等[9]的操作方法并根據具體條件稍作修改，于模型刺激21 d測試，實驗前為減少小鼠緊張感，提前1 h將小鼠移至安靜的實驗室。實驗時將小鼠置于直徑15 cm的上方開口的透明圓柱形容器之中，水深15 cm，水溫(23±2)℃，持續6 min，全程通過攝像機記錄，統計后5 min內小鼠不動的總時間。每只小鼠實驗后換水并清洗側壁以防止殘留氣味影響實驗。小鼠在水中確保頭部浮起并停止掙扎或偶爾滑動并保持漂浮判斷為不動狀態[10]。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 攝食量變化

結果見表1。與對照組相比，第1周攝食量上升，無顯著性差異(P>0.05)。第14天攝食量下降,無顯著性差異(P>0.05)，第21天攝食量明顯下降，差異具有極顯著性(P<0.01)。

表1 兩組小鼠食物消耗量Table 1 Two groups of mice food

2.2 行為學各項指標變化

見表2。與對照組相比，LTMS組強迫游泳實驗中不動時間明顯延長，差異具有極顯著性(P<0.01)。曠場試驗中，LTMS組小鼠穿越格數和直立次數均明顯少于對照組，差異具有極顯著性(P<0.01)。高架十字迷宮實驗中，LTMS組小鼠閉合臂停留時間明顯延長，差異具有極顯著性(P<0.01)，開臂進入次數占比次數減少，差異具有顯著性(P<0.05)。

表2 兩組小鼠行為學指標比較Table 2 two groups of mice behavior index

3 討論

抑郁癥是一類以思維遲緩、情緒低落、主動性下降和興趣減低等精神運動性遲滯癥狀為主要表現的心境障礙綜合征[11]。一個符合臨床表現且穩定的抑郁癥模型是研究致病機制和抗抑郁藥物的重要前提，目前建模的方法很多，如應激模型、損傷模型、化學藥物誘導和基因型改變等。以慢性不可預見性刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)最常用[12]，但是通過CUMS最后所得的抑郁癥動物模型實際操作過程的工作量較大，難以復制。動物模型的衡量標準為表面效度、結構效度和預測效度，表面效度指模型具有相似的臨床表現，結構效度則是具有相應的病理生理學的改變，而模型的疾病表現可被有效的藥物逆轉為預測效度[13]。本研究通過研究長期精神緊張刺激建立模型，通過模擬長期精神打擊來提高實驗結果的可信度。參照孫秀萍等[14]提出的曠場試驗、強迫游泳和高架十字迷宮等抑郁行為實驗方法，觀察動物模型在長期應激作用時是否出現快感缺失、行為絕望和獲得性無助等情緒表現。從而判斷長期恐懼所造成的精神緊張在抑郁癥發病中的作用。

本實驗通過利用小鼠對于貓的恐懼結合睡眠剝奪刺激造模，模擬出抑郁癥患者長期精神緊張表現。貓作為小鼠的天敵，在恐嚇實驗中會造成鼠神經行為學功能退化、單胺類神經遞質含量下降等表現[15]。高江暉等[16]報道，C57BL/6小鼠在睡眠干擾環境中會產生類抑郁樣行為學改變，且隨干擾時間延長，抑郁癥表現程度也相應加重。姚麗華等[17]研究認為在抑郁模型中孤養比群居更具有長期穩定性，本研究結合貓嚇鼠、剝奪睡眠和孤養造模，相對于慢性不可預見性刺激模型的造模時間長、勞動量大、結果不穩定和難以重復的缺點[18]，具有造模方法簡單、易操作的優點，同時又模擬了更貼切實際的精神緊張刺激來提高模型可信度。

本實驗造模前期，小鼠易激惹、焦躁，反抗性強，造模后期精神萎靡，被毛雜亂無光澤，反應遲鈍。對比對照組，LTMS組小鼠應激前攝食量差異無顯著性，在第7天攝食量增加，除了與小鼠處于快速生長期有關，前期的精神緊張刺激可能加劇了小鼠攝食量，LTMS組小鼠在第14天之后攝食量減少，在第21天攝食量明顯減少并有顯著性差異。同時小鼠體質量增長也緩慢，提示長期的貓嚇和睡眠剝奪影響了小鼠進食欲望，并導致其生長遲緩。第28天時，模型組小鼠被毛暗淡，活動性差且外物刺激時反應遲鈍。造模期間3只小鼠死于刺激，死亡率為30%。強迫游泳實驗中將小鼠放在盛水的圓柱容器內，最初在水中表現出劇烈掙扎并試圖逃脫，但當發現無法逃脫時便停止掙扎，頭部露出水面保持一種在水中漂浮不動的狀態，此狀態稱為“行為絕望”[15]。本實驗中，LTMS組小鼠不動時間顯著性延長，表現出了行為絕望狀態。曠場試驗中，小鼠穿越水平格數和站立次數可以反映活動度和探究行為[19]。LTMS組小鼠穿越格子數(水平運動)和直立次數(垂直運動)較對照組明顯減少，反映了小鼠的活動度降低和對新鮮環境的探索欲望降低。高架十字迷宮實驗中，小鼠在與外界環境相通的開臂中會有一定的新奇性和探索欲望，小鼠由于嗜暗性會傾向于在閉臂中活動，但出于好奇心和探究性又會在開臂中活動[20]。焦慮抑郁水平高的小鼠會退縮到閉臂中，反之對開臂的探究次數則增多[21]。本研究結果顯示，LTMS組小鼠進入開臂的次數比例顯著下降，且在閉臂時間顯著增加，提示產生焦慮行為。

綜上所述，長期精神緊張刺激模型表現出的行為絕望、活動能力下降、興趣喪失和焦慮與抑郁癥臨床表現相似，且結合孤養模擬了抑郁癥發病的常見因素，成功地建立了符合表面效度的小鼠抑郁模型。