TMAO通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路影響心臟原代成纖維細(xì)胞的增殖

趙 雨 劉向東 呂家順 張慶勇

在人體攝入富含卵磷脂、膽堿、L-肉堿的高脂營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，經(jīng)某些特定的腸道微生物酶復(fù)合物的分解代謝，首先產(chǎn)生三甲胺(trimethylamine，TMA)。TMA進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)后，經(jīng)肝臟含黃素單氧化酶(flavin-containing monooxygenases)氧化，即產(chǎn)生TMAO[1]。TMAO除了與慢性腎臟疾病、2型糖尿病及肥胖關(guān)系密切外，還參與心血管代謝性疾病，如心肌肥大、心臟纖維化。TMAO的產(chǎn)生、代謝過(guò)程與心血管疾病的發(fā)生高度相關(guān)，可作為心血管疾病治療的潛在靶點(diǎn)[2,3]。

心臟間充質(zhì)細(xì)胞，也被簡(jiǎn)稱為“成纖維細(xì)胞”，是心臟中分布最廣的細(xì)胞類型之一[4]。哺乳動(dòng)物心臟的正常功能主要由心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞(CF)相互協(xié)調(diào)、相互作用來(lái)維持的，這兩種細(xì)胞占心臟細(xì)胞的90%[5]。在人類心臟中，心臟成纖維細(xì)胞占60%～70%，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源，除在細(xì)胞和非細(xì)胞組分間的機(jī)械、化學(xué)、電信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用外，在高血壓、心肌梗死及心力衰竭發(fā)生時(shí)的心臟重構(gòu)過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[6]。腸道菌群代謝對(duì)人體的影響日益受到關(guān)注，但其代謝產(chǎn)物是如何影響人體病理生理進(jìn)程的，是否會(huì)對(duì)心臟重構(gòu)造成影響，尚缺乏足夠研究，本研究旨在探索TMAO影響心臟成纖維細(xì)胞增殖的可能作用機(jī)制。

材料與方法

1.材料: 小鼠原代心臟成纖維細(xì)胞購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司; 一抗抗體PI3K(phosphatidyl inositol 3-kinase,#4292)、p-PI3K(Tyr458,#4228)、AKT(protein kinase B,#9272)、p-AKT(Thr308,#13038)、mTOR(mammalian target of rapamycin, #2972)、p-mTOR(#2974)、GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,#5174)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司; 二抗山羊抗兔購(gòu)自北京博奧森公司;DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)、胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公 司; 氧化三甲胺(TMAO)、LY294002(PI3K抑制劑)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide， DMSO)購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司; BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司; 增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL) 顯影液購(gòu)自美國(guó)Thermo公司; PowerPac Universal 電泳裝置購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司; EPOCH 型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

2.方法: (1) 細(xì)胞培養(yǎng):在5% CO2、37℃的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)原代心臟成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后使用PBS 2毫升/次沖洗 2次，然后加入 2ml 0.25%的胰酶消化1min，再加入2ml培養(yǎng)液終止消化。使用槍頭將貼壁細(xì)胞吹打下來(lái)，將細(xì)胞懸液吸入15ml離心管以 0.9×g速度離心3min，離心后棄去上清，將細(xì)胞混勻后按以5×105細(xì)胞密度接種于6孔板中。(2) 細(xì)胞處理: 濃度梯度組：分別用含0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0μmol/L TMAO的培養(yǎng)基培養(yǎng)原代心臟成纖維細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞；時(shí)間梯度組：分別用TMAO處理原代心臟成纖維細(xì)胞0、15、30、60min；抑制劑組：在用TMAO處理細(xì)胞前，加入PI3K抑制劑LY294002 10μmol/L預(yù)處理細(xì)胞30min。(3)Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá): 處理結(jié)束后，每孔加入100μl 含1%苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)和10%磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。待細(xì)胞充分裂解后離心，取上清后使用BCA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量，濃度調(diào)齊后煮沸15min。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 跑完后用二氟乙烯(polyvinylidene floride，PVDF)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。然后40ml TBST中加入2g牛奶混勻后于室溫下將膜封閉2h， 一抗PI3K、p- PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、GAPDH 4℃ 孵育過(guò)夜。TBST 10分鐘/次將膜洗滌3次。室溫下孵育二抗 2h，TBST 10分鐘/次將膜洗滌 3 次。使用 Image Quant LAS 4000 mini 進(jìn)行顯影。

結(jié) 果

1.在用不同濃度的TMAO處理心臟成纖維細(xì)胞后，各蛋白表達(dá)量的變化：Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，隨著TMAO濃度不斷提高，p- PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，其中p- PI3K 在TMAO為10μmol/L 的時(shí)候表達(dá)量最高，p-AKT和p-mTOR在TMAO為25μmol/L 的時(shí)候表達(dá)量最高。

2.用濃度為10 μmol/L的TMAO，分別處理心臟成纖維細(xì)胞0、15、30、60min后，各蛋白表達(dá)量的變化：隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，其中p- PI3K 在培養(yǎng)30min的時(shí)候表達(dá)量最高，p-AKT和p-mTOR在培養(yǎng)60min的時(shí)候表達(dá)量最高。

3.PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路各蛋白表達(dá)量的變化：用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞30min后，再用10μmol/L 的TMAO處理細(xì)胞后，與單純用TMAO處理的細(xì)胞比較，同時(shí)用PI3K抑制劑處理組，其p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)量明顯減少。

討 論

一直以來(lái)，飲食都被認(rèn)為與心血管疾病的發(fā)生有關(guān)，而近幾年的研究也表明，營(yíng)養(yǎng)攝入、腸道菌群代謝參與宿主心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。此外，宿主體內(nèi)微生物產(chǎn)生的多種代謝物，如氧化三甲胺、短鏈脂肪酸(short chain fat acids,SCFAs)和次級(jí)膽汁酸(secondary bile acids)，也會(huì)參與心血管疾病的病理生理過(guò)程。盡管一些強(qiáng)效降脂藥已廣泛應(yīng)用于臨床，心血管疾病位居是發(fā)達(dá)國(guó)家人口死亡原因之首，因此進(jìn)一步明確心血管疾病治療的靶點(diǎn)勢(shì)在必行[7]。近10年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，氧化三甲胺(TMAO)、短鏈脂肪肪酸(SCFAs)和次級(jí)膽汁酸在心血管疾病的發(fā)展中發(fā)揮特定作用，盡管一些大型抗生素治療試驗(yàn)未能發(fā)現(xiàn)可以讓心血管疾病患者獲益，但目前心血管藥物研究?jī)叭灰堰M(jìn)入以腸道菌群代謝產(chǎn)物為靶點(diǎn)的新領(lǐng)域[8,9]。有研究發(fā)現(xiàn)，TMAO可以通過(guò)TGF-β/SMAD3信號(hào)通路促進(jìn)心臟和腎臟的纖維化[10]。

圖1 TMAO不同濃度處理后，信號(hào)通路各蛋白表達(dá)量的變化A.Western blot法檢測(cè)不同濃度的TMAO處理心臟成纖維細(xì)胞后各磷酸化蛋白表達(dá)的變化；B.p- PI3K/PI3K；C.p-AKT/AKT；D.p-mTOR/mTOR

圖2 TMAO不同時(shí)間處理后，信號(hào)通路各蛋白表達(dá)量的變化A.Western blot法檢測(cè)用濃度為10μmol/L的TMAO處理心臟成纖維細(xì)胞不同時(shí)間后各磷酸化蛋白表達(dá)量的變化;B.p-PI3K/PI3K;C.p-AKT/AKT;D.p-mTOR/mTOR

圖3 PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理后，信號(hào)通路各蛋白表達(dá)量的變化A.Western blot法檢測(cè)經(jīng)PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理心臟成纖維細(xì)胞后各磷酸化蛋白表達(dá)的變化；B.p-PI3K/PI3K;C.p-AKT/AKT;D.p-mTOR/mTOR。與抑制劑預(yù)處理組比較，*P<0.05

在健康的心臟中，成纖維細(xì)胞是參與心臟結(jié)締組織形成和維持的主要細(xì)胞類型。心臟結(jié)締組織包含細(xì)胞和非細(xì)胞成分，其中的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)可以為心肌細(xì)胞提供穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，使心臟成為一個(gè)整體[6]。而纖維化是許多常見心血管疾病諸如心肌梗死和高血壓的自然后遺癥，并且通常加劇心血管疾病和心力衰竭的進(jìn)展，此外，心臟局部瘢痕和散在纖維化也是擾亂正常電生理活動(dòng)、導(dǎo)致心律失常發(fā)生的獨(dú)立因素，但目前還沒有專門針對(duì)纖維化的治療方法[11]。因此，控制心臟成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞增殖、表型轉(zhuǎn)化和基質(zhì)合成這些行為的調(diào)節(jié)過(guò)程和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑代表了抗纖維化治療發(fā)展的研究重點(diǎn)[12]。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可通過(guò)多種潛在機(jī)制影響細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活及糖吸收[13]：PI3K通過(guò)產(chǎn)生三磷酸磷脂酰肌醇引起信號(hào)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，并激活A(yù)KT；AKT可以對(duì)胞內(nèi)胞外多種刺激作出反應(yīng)，是細(xì)胞存活重要的調(diào)節(jié)器；mTOR作為一種相對(duì)分子質(zhì)量為289000的非典型絲蘇氨酸蛋白激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，主要受PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的調(diào)控[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TMAO增加了PI3K/AKT/mTOR細(xì)胞增殖信號(hào)通路中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)量，說(shuō)明TMAO可能通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路影響心臟成纖維細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，筆者使用了PI3K抑制劑LY294002將PI3K的活性抑制后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)量均明顯降低，即使加入TMAO處理，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)量也未發(fā)生明顯升高，進(jìn)一步表明了TMAO可以通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TMAO可以激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，并可能通過(guò)該信號(hào)通路促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的增殖，這有助于進(jìn)一步了解TMAO促進(jìn)心臟纖維化的分子機(jī)制，而TMAO促纖維化是否還有其他分子機(jī)制參與，尚需進(jìn)一步探究。