超聲靶向破壞微泡技術介導的胰腺癌腫瘤成像及促進紫杉醇和Ki67-siRNA的協同抗癌效果研究

高 峰 李 凡 孫 婷 鄒鵬林 劉 龍 金利芳 邵春娟 史秋生 杜聯芳

胰腺癌(PaCa)是一種世界上最常見的惡性腫瘤，也是造成患者死亡的主要癌癥之一[1]。在歐洲和美國，在與癌癥相關的疾病致死案例中，PaCa排名第4位。雖然近些年來大量科研工作者不斷提出新的方案來治療PaCa，但其治愈率仍維持在一個很低的水平，給公共醫療和社會資源造成了巨大的負擔[2]。研究顯示，在PaCa常規化療中存在的最主要問題之一是化療藥物滲透性差，難以通過細胞膜，造成癌細胞內藥物濃度低，因此無法有效殺傷腫瘤[3,4]。超聲分子影像學技術為解決這一問題提供了新的思路，特別是對于藥物遞送來說，超聲靶向破壞微泡(ultrasound targeted microbubble destruction, UTMD) 技術可以利用微泡在超聲介導下產生的空化效應增加血管及細胞膜通透性，促進抗癌藥物或大分子進入細胞， 提高靶點細胞內的藥物濃度，達到高效治療并減少正常組織毒性不良反應的效果[5]。而且，UTMD技術具有造影效果，可以為實時監測腫瘤治療效果提供便利[6]。另外，由于腫瘤部位細胞不受控制的增殖水平，需要大量的血管來輸送營養物質及氧氣，因此腫瘤位置血管生長豐富[7]。據文獻報道，增殖細胞 Ki67 蛋白是一種與血管壁細胞增殖密切相關的核蛋白，抑制Ki67的表達可以降低血管細胞的生長水平，從而阻斷腫瘤細胞的營養及氧氣供應[8]。本課題組之前的研究結果顯示，UTMD技術可以有效促進siRNA轉染細胞，且通過超聲定點照射病灶(腫瘤)位置，具有特異、高效的特點[9，10]。筆者在前期工作基礎上，將抗癌模型藥物紫杉醇(PTX)與Ki67沉默siRNA共給藥治療PaCa，并輔以UTMD研究其抗癌效果，為今后醫學上治療PaCa提供理論基礎。

材料與方法

1.材料與試劑：PaCa細胞(SW1990) 購自中國科學院上海細胞庫；1640培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶以及PBS緩沖液均購自美國Gibco公司；PTX購自北京百靈威科技有限公司；Ki67 siRNA合成及質粒構建購自上海吉瑪科技公司；超聲微泡造影劑聲諾維(SonoVue) 購自意大利 Bracco 公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒購自江蘇凱基生物科技公司；SPF級雄性BALB/c 裸鼠 (6～8周, 體質量17～20g，購自上海Sippr-BK實驗動物有限公司)；PIPA組織裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑以及BCA蛋白定量試劑盒均購自北京碧云天生物科技有限公司；Anti-Ki67抗體購自英國Abcam公司(ab15580)，Anti-β-actin抗體購自美國Cell Signalling Technology 公司，二抗購自北京中杉金橋公司；PVDF膜和化學發光ECL試劑購自美國Millipore公司；Tween-20、伊紅和蘇木精染液均購自北京索萊寶生物試劑公司。

2.細胞培養及CKK-8法檢測細胞存活率：購買的SW1990細胞培養在T25培養瓶中，內含5ml的RPMI-1640培養基，培養基中含有10%的胎牛血清, 青霉素 (100U/ml) 和鏈霉素(100mg/ml)，所有培養的細胞靜置于5%CO2、37℃恒溫的培養箱中生長。當細胞長滿培養瓶時，用胰蛋白酶消化下細胞，種入96孔細胞培養板中，每孔密度約為1×105個細胞/孔，每孔加入180μl全培養基培養24h。實驗分組：(1)空白對照組：每孔細胞中加入20μl的PBS溶液。(2)PTX組：將PTX溶醞10%DMSO中，向每孔中加入20μl,使PTX溶液最終濃度為50μg/ml。(3)PTX+UTMD組：每孔中加入20μl PTX溶液以及50μl SonoVue溶液，維持每孔的總體積為200μl，使PTX最終濃度為50μg/ml，同時將超聲探頭涂抹少量耦合劑，貼于96孔板底部進行超聲輻照，根據本課題組前期優化結果輻照條件選擇：超聲功率1.0W/cm2；占空比20%；輻照時間60s。(4)Ki67 siRNA組：每孔加入20μl Ki67 siRNA溶液，使Ki67 siRNA最終濃度為10μg/ml。(5)Ki67 siRNA+UTMD組：每孔中加入20μl Ki67 siRNA溶液以及50μl SonoVue溶液，使Ki67 siRNA最終濃度為10μg/ml，并進行超聲輻照。(6)PTX+Ki67 siRNA+UTMD組：每孔中加入10μl PTX溶液同時加入10μl Ki67 siRNA溶液以及50μl SonoVue溶液，使PTX最終濃度為50μg/ml，Ki67 siRNA最終濃度為10μg/ml，并進行超聲輻照。37℃ 孵育24h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃孵育4h后在酶標儀(PowerWave XS, Bio-Tek) 上450nm測量吸光度，每種用藥設定6個副孔，每組實驗重復3次。

3.動物造模及分組：36只BALB/c 裸鼠于20～22℃無菌環境下飼養，小鼠自由進食及進水，適應性喂養2周后，所有小鼠隨機分為6組(每組6只)，通過注射器在皮下組織注射150μl約 5×106個SW1990細胞，構建小鼠PaCa皮下瘤模型，造模位置在小鼠后背大腿上方。按照公式腫瘤體積V=長×寬×高×π/6記錄皮下瘤直徑，當V達到100～120mm3時，開始給藥治療，空白對照組(control組)給予荷瘤小鼠瘤內注射20μl生理鹽水、PTX組注20μl PTX溶液 (5mg/kg)、Ki67 siRNA組注射20μl Ki67 siRNA質粒溶液(1mg/kg)，每兩天給藥1次。輔助UTMD治療組的荷瘤小鼠，在注射藥物15min后，在小鼠眼眶后靜脈注射(4ml/kg) SonoVue造影劑，然后將超聲探頭涂上耦合劑后置于皮下瘤組織，以超聲功率1W/cm2進行超聲輻照時間6min。給藥15天后超聲造影檢測荷瘤小鼠瘤體抑制效果，30天后處死所有小鼠。

4.蛋白質免疫印跡(Western blot)法檢測分析：體外培養的各治療組SW1990細胞，胰蛋白酶消化后，3000r/min離心收集細胞，沸水浴中煮30min后提取總蛋白。荷瘤小鼠出死后的腫瘤組織，取約20mg置于加有PMSF的10% RIPA組織裂解液中勻漿提取樣本總蛋白，BCA法定量總蛋白質濃度。各樣本取50μg， 10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠106V恒壓電泳2.5h分離蛋白，將目的蛋白半干法轉移到PVDF膜上, 5%脫脂奶粉中封閉2h后，加入Ki67一抗(1∶500)或β-actin (1∶2000)一抗, 4℃孵育過夜。取出膜帶后，清洗3次，在室溫下孵育相應的辣根酶標記二抗2h。最后在蛋白條帶上加入ECL化學發光試劑，暗室曝光，壓片于膠片上，掃描膠片，使用Image J專業圖像分析軟件掃描灰度值，用 β-actin標準化蛋白表達量，每組實驗重復3次。

5.Ki67免疫組織化學(IHC)檢測:所有荷瘤小鼠處死后，收集腫瘤組織經PBS沖洗干凈后行免疫組織化學染色檢測腫瘤組織內Ki67表達水平變化。各腫瘤組織樣本浸于4%甲醛溶液中固定48h，取出后石蠟包埋，切片機上制成4μm組織切片，切片進行封閉2h， 加入一抗(Anti-Ki67抗體，1∶1000)，搖床放置2h后4℃過夜， 加入二抗(1∶2000),封片,顯微鏡下采集圖片。每個樣本選取3個隨機視野，觀察視野中Ki67陽性細胞數。

6.HE組織學檢測:按照免疫組織化學步驟收集腫瘤組織，并制成石蠟切片。分別加上伊紅和蘇木精溶液染色，DAB復染，制成HE染色切片。所有HE染色切片在光學顯微鏡下采圖，收集圖片，每個樣本隨機選取3個觀察視野。

結 果

1.各組細胞藥物處理后Ki67蛋白表達改變：體外培養的PaCa細胞(SW1990)經各組藥物孵育24h后，經Western blot法檢測發現，與PBS處理后的空白對照組比較，PTX處理后Ki67的蛋白表達水平未發生明顯變化(P>0.05), 增加UTMD處理后也未能使Ki67的表達上升；而SW1990細胞在經過Ki67 siRNA處理后，Ki67的蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。在加入UTMD處理后，Ki67的蛋白表達水平進一步降低，顯示出UTMD對基因轉染較強的促進作用，對細胞同時給予PTX和Ki67 siRNA處理，Ki67的下降水平與Ki67 siRNA組相似(圖1)。

圖1 SW1990細胞經各組藥物處理后Ki67蛋白表達變化與空白對照組比較,*P<0.05

2.各組藥物對PaCa細胞增殖的影響：細胞與藥物共培養24h后，經CCK-8檢測發現，與空白對照組比較，PTX對腫瘤細胞有明顯的殺傷作用(P<0.05)，而UTMD的輔助治療增加了藥物在細胞中的滲透性，使得細胞的存活率更低(P<0.01)；Ki67 siRNA的孵育可以降低細胞中Ki67的表達，也會對細胞增殖有抑制作用，差異無統計學意義(P>0.05)，但是UTMD的輔助使得其對細胞增殖的抑制作用增強，與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；PTX與Ki67 siRNA聯合給藥并輔以UTMD，顯示出了最低的細胞存活率(P<0.01)，其對腫瘤細胞的殺傷作用大于單獨PTX與Ki67 siRNA效果之和(圖2)。

圖2 SW1990細胞經各組藥物處理后細胞存活率變化與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

3.UTMD介導的小鼠腫瘤組織超聲造影：各組裸鼠在皮下SW1990細胞腫瘤造模成功后，予以各組藥物治療。15天后，經UTMD超聲造影觀察顯示，空白對照組小鼠的腫瘤體積大，邊緣清晰，血供豐富；PTX治療后腫瘤體積縮小，血供開始減少，腫瘤中央出現空隙，說明其內部細胞開始壞死，而每次給藥后的UTMD輔助，明顯增加了腫瘤組織的壞死，中央空隙變得更大；Ki67 siRNA治療組小鼠，也出現了腫瘤組織的壞死，以及血供減少現象，UTMD促進了腫瘤細胞對Ki67 siRNA的攝取，進一步減少了腫瘤內部血供；PTX+Ki67 siRNA+UTMD組腫瘤組織則明顯縮小，血供稀少，中央幾乎完全壞死(圖3)。

圖3 荷瘤小鼠經各組治療后第15天腫瘤組織的超聲造影

4.Western blot法檢測小鼠腫瘤組織Ki67變化：造模成功后，荷瘤小鼠經各組藥物處理30天后，腫瘤組織經Western blot法檢測結果顯示，與空白體外細胞實驗結果相似，與空白對照組比較，PTX沒有對腫瘤組織Ki67的蛋白表達水平產生明顯影響(P>0.05), 而在經過Ki67 siRNA處理后，Ki67的蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)，且在加入UTMD處理后，Ki67的蛋白表達水平進一步降低(P<0.01)；對荷瘤小鼠同時給予PTX和Ki67 siRNA注射，并輔以UTMD處理后，腫瘤組織中Ki67的表達水平也出現了明顯的下降(P<0.01，圖4)。

5.免疫組織化學檢測各組小鼠腫瘤組織Ki67蛋白表達：PaCa荷瘤小鼠在經過各組藥物處理30天后，腫瘤組織病理切片經Ki67抗體染色結果發現，與Western blot法結果相似，Ki67 siRNA順利轉染到了腫瘤細胞內，成功的抑制了Ki67蛋白的表達，而UTMD可以促進siRNA的轉染，因此，與空白對照組比較，Ki67 siRNA以及Ki67 siRNA+UTMD組腫瘤組織內Ki67陽性細胞數顯著降低，PTX+Ki67 siRNA+UTMD處理后腫瘤組織內Ki67陽性細胞的數量最低，而PTX對腫瘤細胞內Ki67的表達沒有顯著影響，詳見圖5。

6.各組荷瘤小鼠腫瘤組織形態結構變化：荷瘤小鼠在經過各組藥物治療30天后，腫瘤組織切片HE染色觀察發現，經生理鹽水處理的空白對照組小鼠腫瘤組織形態正常，細胞豐富，細胞核較大，胞質胞核，未見壞死現象；PTX或Ki67 siRNA處理后，小鼠腫瘤組織均出現不同程度壞死，癌細胞萎縮，細胞邊緣開始皺縮，伴隨片狀壞死；而加助UTMD處理后，這兩種藥物處理后的腫瘤組織壞死程度都顯著加深，其中PTX+Ki67 siRNA+UTMD處理后腫瘤的壞死程度最為顯著，詳見圖6。

圖4 腫瘤組織經各組藥物處理后Ki67蛋白表達變化與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

圖5 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Ki67蛋白表達(IHC,×200)A.空白對照組；B.PTX組；C.PTX+UTMD組；D.Ki67 siRNA組；E.Ki67 siRNA+UTMD組；F.PTX+Ki67 siRNA+UTMD組

圖6 各組荷瘤小鼠腫瘤組織形態結構變化(HE,×100)A.空白對照組；B.PTX組；C.PTX+UTMD組；D.Ki67 siRNA組；E.Ki67 siRNA+UTMD組；F.PTX+Ki67 siRNA+UTMD組

討 論

在全球范圍內，PaCa是發生率和病死率最高的惡性腫瘤之一，且其預后極差[9]。由于PaCa起病非常隱匿，在臨床上大多數患者一經就診發現時就已處于病程晚期，此階段已無法通過手術切除的手段而控制病情。因此只能依靠服用抗腫瘤藥物來控制病情，而目前常用的臨床藥物普遍存在靶向性差、對機體毒性不良反應強、易產生耐藥性等缺點。PTX就是一種此類的化療藥物，臨床上用藥后，PTX不能高效地進入腫瘤細胞內發揮殺傷作用，游離在腫瘤細胞以外的PTX就會對正常組織產生損傷[10]。為此尋找其他的輔助治療手段來增加化療藥物在腫瘤位置的靶向滲透性迫在眉睫。目前，已有大量研究證實UTMD能夠通過瞬間空化作用增加細胞膜滲透性有效介導化療藥物及大分子進入細胞，從而發揮靶向性治療作用。本研究通過CCK-8以及HE染色實驗也證實，在對腫瘤細胞或荷瘤小鼠給藥后，輔助UTMD處理，可以顯著增加PTX的抗腫瘤效果，SW1990細胞存活率降到更低，腫瘤組織切片壞死更嚴重，這些都驗證了UTMD促進藥物滲透發揮殺傷作用的效果。

另一方面，基因治療是當前一種腫瘤治療的研究熱點，通過特異性的沉默細胞內目標基因，抑制其功能蛋白的表達以此抑制腫瘤的增殖，達到抗腫瘤效果[11]。但是基因治療同樣存在著滲透性差、轉染效率低的問題。本實驗選擇了一種與細胞增殖密切相關的蛋白質——Ki67。Ki67經常被用來評價細胞增殖活性和腫瘤的生長及惡性程度。將Ki67 siRNA與PTX聯合用藥來治療PaCa。結果顯示，PaCa細胞和荷瘤小鼠在經過Ki67 siRNA處理后，Ki67的蛋白表達水平都明顯下降，且在加入UTMD處理后，Ki67的蛋白表達水平進一步降低。PTX沒有對腫瘤細胞中Ki67的蛋白表達水平產生明顯影響。HE結果也證明，UTMD處理能夠顯著加深PTX或Ki67 siRNA治療后，小鼠腫瘤組織的壞死程度，而PTX+Ki67 siRNA+UTMD處理后腫瘤的壞死程度最為顯著。除此之外，UTMD技術還可以造影成像，用來實時監測腫瘤的生長情況，筆者通過實驗觀察到UTMD促進了腫瘤細胞對Ki67 siRNA和PTX的攝取，進一步減少了腫瘤內部血供，促進了腫瘤組織壞死。

綜上所述，UTMD技術具有高效、實用、靶向以及可成像等優點，可以作為臨床化療和基因治療的輔助手段來治療PaCa，是未來的研究發展方向之一，將UTMD和其他療法聯合在腫瘤的治療中必將具有極為廣闊的應用前景。