心理應激誘導ROS產生在食管上皮細胞間隙增寬發生中的作用機制

買買提·依斯熱依力 吾布力卡斯木·吾拉木 李義亮 艾克拜爾·艾力 阿孜古麗·阿力木江 曹正一 阿布拉江·米吉提 蔣 媛 趙新勝 克力木·阿不都熱依木

隨著社會的發展和生活節奏的加快，心理應激在各種疾病中的作用變得越來越突出。據報道，心理應激已成為75%～90%的疾病的共同危險因素[1]。胃食管反流(gastroesophageal reflux disease, GERD)是消化系統常見的功能性疾病，其發生、發展與心理因素之間的相關性已得到證實。焦慮和抑郁等心理因素增加罹患GERD的風險，同時會導致GERD癥狀的加重[2,3]。

食管黏膜防御功能主要由上皮屏障構成，任何一種或多種防御機制的缺陷均可導致食管對胃內容物(胃酸、膽汁等)清除能力降低，繼而引起食管上皮損傷，食管上皮細胞緊密連接(tight junction, TJ)蛋白的表達下降是其重要發生機制[4]。GERD患者食管上皮TJ蛋白表達異?？芍苯訉е率彻苌掀ぜ毎g隙增寬(dilated intercellular space, DIS)，這一組織學變化也許能作為GERD食管形態結構異常的客觀指標[5]。

食管上皮的通透性取決于TJ蛋白的完整性。在GERD動物模型中，食管黏膜暴露于酸或酸化的胃蛋白酶環境會使TJ蛋白破壞，從而造成細胞旁通路對水、電解質和低分子物質的通透性增加，導致食管鱗狀上皮出現DIS[6]。這可能是部分難治性GERD患者使用質子泵抑制劑(proton pump inhibitors, PPIs)治療后，癥狀仍持續存在的原因之一?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)在許多疾病發展中發揮著重要作用，也被認為是GERD、Barrett食管的發病重要機制之一。因此，本研究通過建立小鼠慢性束縛應激(Stress)模型，探討心理應激誘導活性氧(ROS)介導的食管TJ蛋白表達及在DIS發生中所產生的影響。

材料與方法

1.實驗動物及分組:SPF級雄昆明小鼠25只，8周齡，購于新疆實驗動物研究中心，實驗動物許可證號：SCXK(新)2011-0001；飼養于新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所IVC系統動物中心。25只小鼠進行編號及體質量測量，并排除體質量變異較大的5只。采用Microsoft Office Excel軟件隨機分為兩組(各10只)，即慢性束縛應激(Stress)組和正常對照(Control)組。小鼠單只飼養在自由進食水的鼠籠內，每日給予12h晝夜循環，光照均始于8：30時，止于20：30時。

2.Stress模型的建立:所有小鼠在相同環境中適應性喂養1周。模型開始建立后，所有束縛應激均在每日上午10：30時～12：30時進行。10只Stress組小鼠置于用50ml離心管所制的自制式束縛器中(離心管提前燙制出直徑約5mm的通氣孔若干，分布于左右及上側管壁，管口塑料蓋做1個小孔以暴露小鼠尾巴)，每天限制活動2h，期間禁食禁水，后放回鼠籠內自由活動，連續束縛14天。Control組小鼠自由飲水攝食，其余時間兩組小鼠處理相同。

3.取材與標本處理:束縛應激第14日下午17：00時開始對所有小鼠禁食，于次日11：00時進行取材。麻醉的小鼠以平臥位固定，從腹部正中至劍突取切口取3cm切口，下腔靜脈取血注入于1.5ml EP管中。在距離胃食管交界處0.3cm處和1.5cm處剪斷取材，置于4%中性甲醛固定。食管標本4%中性甲醛固定24h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4μm厚切片行HE染色。各組食管下段組織常規HE染色后，光學顯微鏡(油鏡)下并放大千倍不同部位上拍攝10張光鏡照片，使用Image J等圖像處理軟件數字化測量細胞間隙。

4.免疫組化染色:石蠟切片脫蠟水化后，10%過氧化氫甲醛阻斷過氧化物酶，檸檬酸法高壓修復抗原，山羊血清封閉1h，分別在不同切片滴加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4, Nox-4)一抗(1∶100)，4℃過夜，滴加二抗，37℃孵育30min，DAB顯色。以PBS 液取代一抗作為陰性對照。每只小鼠胃組織標本隨機取兩張切片，光鏡下觀察胃黏膜染色情況，在200倍鏡下隨機取5個視野，應用Image-Pro Plus 6.0軟件進行拍照，以明顯黃色/棕黃色細胞為陽性細胞。

5.實時定量RT-PCR:采用實時定量RT-PCR方法檢測Nox-4、Nrf-2、HO-1、閉合蛋白-1(Claudin-1)、閉合蛋白-4(Claudin-4)、咬合蛋白(Occludin)及胞質緊密黏連蛋白-1(zonula occludens, ZO-1)mRNA的表達。取每只小鼠食管組織20mg，采用TRIzol試劑提取總RNA，采用天根公司Fast Quant RT試劑盒合成第一鏈cDNA。由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成引物，各指標及β-肌動蛋白(actin)引物序列和擴增產物長度見表1。RT-PCR反應嚴格按照試劑盒操作說明進行。實時定量RT-PCR,反應體系為20μl，反應條件為94℃ 3min,然后95℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 20s，共40循環。反應結束后由電腦自動得出熒光曲線及CT 值,采用2—△△Ct計算出Stress組小鼠食管組織相對于Control組中目標基因的相對表達倍數。

6.蛋白質印跡(WB)法:加入50mmol/L PIPA蛋白裂解液裂解組織細胞，提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量。每孔50μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至聚偏二佛乙烯(PVDF)膜上，封閉，洗膜后加一抗(1∶1000)4℃過夜，然后用1×TBST洗膜3次×5min，再與二抗(1∶10000)室溫孵育1h，在用1×TBST洗膜3次×5min。β-actin作為內參照。置于凝膠成像儀中照相并應用Image J軟件對核轉錄因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf-2)及血紅素氧合酶-1(heme oxygenase, HO-1)及β-actin蛋白質條帶灰度進行定量分析處理，用Nrf-2與HO-1蛋白目的條帶與β-actin條帶的灰度值比值表示Nrf-2、HO-1蛋白相對表達強度(Nrf-2/β-actin、HO-1/β-actin)。

表1 實時定量RT-PCR引物序列及產物長度

7.酶聯免疫吸附(ELISA)測定:取血后不經任何處理，4℃下靜置2h，之后以3500r/min的速度低溫離心5min，取上層血清，-80℃保存，用于后續測定。ELISA法檢測血清中Nox-4、8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine, 8-OHDG)及丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量。實驗過程及測量指標濃度的計算嚴格按試劑盒說明書進行。

結 果

1.Stress對小鼠體質量、進食量的影響：實驗開始前Stress組小鼠體質量為25.85±1.35g，Control組小鼠體質量為24.62±1.43g，兩組比較差異無統計學意義(t=-1.36，P>0.05)；14天的實驗過程中，Stress組小鼠平均每日進食量為12.85±1.42g，Control組為12.98±1.25g，兩組比較差異無統計學意義(t=0.83，P>0.05)；實驗結束后Stress組小鼠體質量增加量為7.95±2.45g，Control組小鼠體質量增加量為11.32±2.23g，兩組比較差異有統計學意義(t=3.78，P<0.01)。

表2 Stress對小鼠體質量和進食量的影響

與Control組比較，*P<0.01

2.Stress對小鼠食管黏膜組織的影響:兩組小鼠食管上皮細胞鏡下測量的平均細胞間隙為Control組0.71±0.18μm、Stress組1.18±0.12μm，與Control組比較，Stress組小鼠上皮細胞間距明顯增寬，差異有統計學意義(P=0.000，圖1)。

圖1 兩組食管上皮細胞間隙測量與Control組比較，*P=0.000

3.氧化蛋白的表達:Nox-4免疫染色陽性著色細胞在Stress組小鼠組織中表達較Control組染色深且豐富，主要表達于固有層、黏膜及黏膜下層。Stress組小鼠食管黏膜中Nox-4 mRNA水平是Control組的2.36±0.34倍，而Stress組血清Nox-4的釋放濃度是Control組的2.25±0.27倍以上，差異有統計學意義(t=-11.56，P=0.000)。ELISA實驗結果顯示，Stress組小鼠中8-OHdG(3.95±0.25 vs 1.65±0.38)和MDA(0.95±0.01 vs 2.48±0.20)的血清表達水平顯著高于Control組，差異有統計學意義(t=-23.45，P=0.000),詳見圖2。

圖2 兩組食管氧化蛋白Nox-4、8-OHdG及MDA表達情況A.食管組織Nox-4免疫組化染色(×200)情況；B.食管組織Nox-4 mRNA相對表達倍數；C.血清Nox-4濃度；D.血清8-OHdG濃度；E.血清MDA濃度。與Control組比較，*P=0.000

4.抗氧化蛋白的表達:抗氧化蛋白的RT-PCR實驗結果顯示，Stress組Nrf-2、HO-1的mRNA轉錄水平明顯低于Control組的1.82±0.35倍，差異有統計學意義(t=-8.25，P=0.000)；蛋白質印跡法檢測表示，Stress組小鼠食管組織中Nrf-2、HO-1蛋白表達水平顯著低于Control組,詳見圖3。

5.TJ蛋白的表達:食管上皮組織TJ蛋白重要指標的RT-PCR實驗結果顯示，Stress組TJ蛋白Claudin-1、Claudin-4、Occludin及ZO-1的mRNA轉錄水平顯著降低，分別是Control組的1.67±0.28、1.54±0.22、1.85±0.35、1.74±0.42倍，差異有統計學意義(t=-8.34、-14.78、-17.63、-12.27，P=0.000)，詳見圖4。

圖3 兩組食管氧化蛋白Nrf-2和HO-1表達情況A.食管組織Nrf-2 mRNA相對表達倍數；B.食管組織HO-1mRNA相對表達倍數；C.Nrf-2和HO-1蛋白表達量。與Control組比較，*P=0.000

圖4 兩組食管組織TJ蛋白的表達情況A.食管組織Claudin-1 mRNA相對表達倍數；B.食管組織Claudin-4 mRNA相對表達倍數；C.食管組織Occludin mRNA相對表達倍數；D.食管組織ZO-1 mRNA相對表達倍數。與Control組比較，*P=0.000

討 論

心理壓力(應激)在GERD發生、發展中起著重要的作用。研究發現，約64%的GERD患者因受到精神壓力的影響可使其癥狀持續加重，這提示反流癥狀的加重與心理因素(抑郁、焦慮)密切有關[7，8]。GERD是一種多疾病綜合征而非單一的發病機制所致，反流癥狀會嚴重影響人的精神和心理狀態。應激是機體在受到心理、環境及生理性(內環境)應激源刺激時所出現的非特異性全身反應。對GERD患者的研究中可發現焦慮、抑郁等心理應激與食管高敏感度有著較密切的聯系。研究發現，伴有焦慮的人群患GERD的風險是正常人的3.2倍，伴抑郁者是其1.7倍，而同時合并焦慮及抑郁者為2.8倍[9]。筆者在前期的研究中發現，不同亞型GERD(NERD、RE)患者中酸反流可激活致敏指標(TRPV-1、PAR-2)受體，進而引起食管高敏感度產生[10]。食管黏膜的損傷、酸反流、食管動力學的改變等都不能全面地解釋GERD胃灼痛、胸痛的癥狀的發生。因此，那些有GERD癥狀而無酸反流的患者癥狀產生機制尚未清楚，心理壓力與食管超微結構改變(如DIS)機制也有待進一步研究。

心理壓力增高是誘導活性氧(reactive oxygen species, ROS)發生的重要機制，而ROS也在GERD、Barrett食管和腺癌等諸多疾病的進程中發揮著重要作用[11,12]。機體在正常的生理情況下，有極少量的自由基(redox)產生，而體內抗氧化防御系統有能力予以清除，redox便處于穩態平衡(redox homeostasis, RH)。但ROS生成過多或抗氧化防御系統的能力降低，redox的穩態失去平衡，此時的穩態失衡可能是急性、短暫性或慢性的，在這種情況下，ROS就能引起生物膜脂質過氧化，細胞內蛋白及酶變形，DNA損害，最后導致細胞凋亡，組織氧化損傷(oxidative stress, OS)[13]。Song等[12]研究表明，GERD發病機制由ROS介導的，他們通過在反流大鼠模型中使用青蒿發現食管黏膜ROS的產生被抑制，黏膜炎癥發生也得到了有效的控制。ROS參與RE食管黏膜的損傷過程，激活細胞內NF-kappa B(NF-κB)等經典信號通路并促進炎性因子如白細胞介素-8(interleukin-8, IL-8)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)的轉錄，使炎性效應繼續擴大，食管黏膜的損傷不斷加重。NADPH為細胞內一組具有氧化活性的酶復合體，是主要的ROS來源，其中Nox-4與ROS關系較密切的氧化酶。8-OHdG的形成是反應組織DNA氧化損傷和致癌的重要生物學標志物。ROS的代謝產物丙二醛(MDA)和不飽和醛引起蛋白質交聯，使蛋白質失去功能，還具有致突變，致癌活性等作用。這些重要ROS標志物在食管組織中表達及上皮細胞間隙增寬(DIS)發生中的意義仍需進一步的研究。

Nrf-2以及下游基因HO-1是細胞內抗氧化防御機制中的重要蛋白體系，該體系通過上調抗氧化酶反應性元件攜帶因子(如內源性抗氧化酶)的轉錄來控制細胞的命運[14]。Nrf2/HO-1通路調控組織或細胞內內源性解毒酶及抗氧化應激酶的表達。Chen等[15]研究發現，Nrf-2-/-基因敲除小鼠出現胃酸反流并導致食管及胃底角化, Nrf2缺乏進一步減少了被回流抑制的單層細胞的跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance,TEER)，從而引起食管DIS、黏膜損傷并使得食管上皮屏障功能異常。因此，機體受到心理應激作用導致ROS產生過多，超出機體氧化物的清除能力，使得氧化與抗氧化系統失衡，而引起氧化損傷的加重。本研究結果顯示，Stress組小鼠食管組織中氧化蛋白重要指標(Nox-4、8-OHdG、MDA)與抗氧化蛋白(Nrf-2、HO-1)的免疫組化、血液中的釋放濃度、mRNA以及蛋白表達量與Control組比較，差異有統計學意義，證明了心理應激所誘導ROS的產生。更重要的是，TJ蛋白指標(Claudin-1、Claudin-4、Occludin、ZO-1)在兩組中mRNA表達量比較，差異有統計學意義。因此，筆者認為氧化/抗氧化防御系統的平衡在維持食管黏膜穩態及屏障中起關鍵作用。

綜上所述，以DIS為代表的食管上皮屏障破壞，可使迷走神經末梢暴露，引起其對各種刺激的反應敏感化，甚至使分布于黏膜上層內的神經突起產生興奮，從而導致軸突末梢釋放神經遞質，直接引起食管感覺異常及疼痛反應。根據本研究結果，筆者認為心理壓力使食管氧化/抗氧化防御系統受損，進而出現食管上皮存在的TJ蛋白結構和功能的異常，可能是GERD發病機制之一。然而，氧化應激參與食管DIS以及高敏感度的產生機制有待于進一步研究。