水飛薊賓對心肌缺血再灌注性心律失常的影響及機制探索

曹旭丹 任春梅 和田田 李素華 李 莉

及時恢復血流是臨床上治療急性心肌梗死的首選方案，但缺血再灌注損傷嚴重影響該患者預后，而心律失常則是其主要表現形式，超過50%的死亡病例的致死原因是心肌缺血再灌注所致心律失常，因此防治心律失常或許是提高急性心肌梗死臨床療效的可靠途徑[1,2]。水飛薊賓(Silibinin，SIL)是一種具有抗氧化、促進細胞再生等多種生物活性的水飛薊素[3,4]。既往研究發現，SIL能夠通過抑制氧化應激、抑制細胞凋亡、改善心功能等而對心肌缺血再灌注損傷起到一定的保護作用[5～7]。但SIL是否對心肌缺血再灌注所致心律失常具有影響尚未見文獻報道。本研究通過制備大鼠心肌缺血再灌注性心律失常模型并提前給予SIL進行預處理，研究SIL對心肌缺血再灌注性心律失常的影響并探索其機制。

材料與方法

1.實驗動物:實驗用SD大鼠(雄性，SPF級，體質量250～300g，鼠齡8周齡)購自河北省實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。飼養環境：室溫23～25℃、相對濕度65%～70%，光照周期12h∶12h，手術前24h禁食、自由飲水。

2.試驗藥物與試劑:水飛薊賓膠囊(天津天士力制藥股份有限公司，藥品規格：35mg/粒，批號：20171103)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20170624、20170813、20171008)；一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：20161229、20170316)；Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20161130、20160924)；鈣標準液(上海生物制品研究所)。

3.實驗方法：(1)動物分組、造模與給藥:取120只實驗用SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組和SIL低[100mg/(kg·d)]、中[200mg/(kg·d)]、高[400mg/(kg·d)]劑量組和維拉帕米組[2.5mg/(kg·d)]，各20只。術前7天開始灌胃給藥(1次/天)，正常對照組和模型組同步灌胃給予0.9%氯化鈉溶液。參照柴麗娜等[8]報道的通過結扎冠狀動脈前降支復制大鼠心肌缺血再灌注性心律失常模型；假手術組除不結扎外，其余操作同模型組。參照Zhang等[9]報道的方法對造模結果進行判斷，心電圖ST段抬高、心肌局部變蒼白表示結扎并缺血成功；松開動脈夾后蒼白區心肌恢復紅潤、ST段抬高程度恢復1/2以上則表示再灌注成功。(2)Ⅱ導聯心電指標監測:記錄心電圖PR間期、QRS間期以及ST段變化，計算各組大鼠室性心動過速(VT)、心室顫動(VF)發生率；然后參照李濤等[10]報道的方法進行心律失常評分：<5次室性前期收縮，計0分；僅≥5次室性前期收縮，計1分；僅<60s室性心動過速，計2分；一陣≥60s或多陣累計<60s室性心動過速，計3分；多陣VT累計>60s，計4分；出現VF計5分。(3)心肌組織生化指標檢測：麻醉后取心臟組織，剪碎，研磨勻漿，經3000r/min低溫(4℃)離心15min后取上清液，遵照試劑盒步驟處理后通過紫外-可見分光光度計測定Na+-K+ATPase、 Ca2+-Mg2+ATPase、SOD、GSH-Px活性和MDA含量；通過原子吸收光度計測定心肌細胞內Ca2+濃度；采用催化L-Arg比色法測定NOS活性，硝酸酶還原法檢測NO含量。

4.統計學方法：運用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行統計分析，多組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.心電圖監測結果:模型組大鼠心電圖PR、QRS間期較假手術組均顯著縮短，ST段明顯升高(P<0.01)；而與模型組比較，經SIL中、高劑量組或維拉帕米組預處理能夠顯著延長心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心電圖PR間期和QRS間期，降低ST段抬高程度，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著SIL給藥劑量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心電圖PR間期和QRS間期呈延長趨勢，ST段抬高程度呈降低趨勢。SIL高劑量組與維拉帕米組比較，PR、QRS間期和ST段比較差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 各組大鼠心電圖監測結果

與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，ΔP<0.01

2.心律失常發生率及評分:模型組室性心動過速(VT)、心室顫動(VF)發生率較假手術組顯著升高(P<0.01)，心律失常評分顯著升高(P<0.01)；而與模型組比較，經SIL中、高劑量組或維拉帕米組預處理能夠顯著降低心肌缺血再灌注性心律失常大鼠VT、VF發生率并降低心律失常評分(P<0.05)。與SIL低劑量組比較，SIL高劑量組大鼠VT、VF發生率顯著降低且心律失常評分顯著降低(P<0.05)。與維拉帕米組比較，SIL高劑量組VT、VF發生率差異均無統計學意義(P>0.05)，心律失常評分顯著降低(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠VT、VF發生率和心律失常評分

與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，ΔP<0.01；與維拉帕米組比較，▲P<0.05

3.ATPase活性和Ca2+濃度:模型組大鼠心肌組織Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性較假手術組降低且心肌細胞Ca2+濃度升高(P<0.01)；而與模型組比較，經SIL中、高劑量組或維拉帕米組預處理能夠顯著提高心肌缺血再灌注性心律失常大鼠Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性并降低Ca2+濃度(P<0.05)。隨著SIL給藥劑量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性呈升高趨勢，Ca2+濃度顯著降低(P<0.05)。與維拉帕米組比較，SIL高劑量組Na+-K+ATPase活性差異無統計學意義(P>0.05)，Ca2+-Mg2+ATPase活性顯著升高且Ca2+濃度顯著降低(P<0.05,表3)。

表3 各組大鼠心肌組織ATPase活性及Ca2+濃度

與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，ΔP<0.01；與維拉帕米組比較，▲P<0.05

4.NOS活性和NO含量:模型組大鼠心肌組織NOS活性和NO含量較假手術組明顯降低(P<0.01)；而與模型組比較，經SIL中、高劑量組預處理能夠顯著提高心肌缺血再灌注性心律失常大鼠NOS活性和NO含量(P<0.05)。隨著SIL給藥劑量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心肌組織NOS活性和NO含量均呈升高趨勢。與維拉帕米組比較，SIL高劑量組NOS活性和NO含量均顯著升高(P<0.05，表4)。

表4 各組大鼠心肌組織NOS活性和NO含量

與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，ΔP<0.01；與維拉帕米組比較，▲P<0.05

5.抗氧化酶活性和MDA含量:模型組心肌組織抗氧化酶SOD、GSH-Px活性較假手術組明顯降低且MDA含量明顯升高(P<0.01)；而與模型組比較，經SIL中、高劑量組預處理能夠顯著降低心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心肌組織SOD、GSH-Px活性并顯著降低MDA含量(P<0.05)，經維拉帕米組預處理能夠顯著提高SOD活性并降低MDA含量(P<0.05)。隨著SIL給藥劑量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心肌組織SOD、GSH-Px活性呈升高趨勢，MDA含量呈降低趨勢。與維拉帕米組比較，SIL高劑量組GSH-Px活性顯著升高且和MDA含量均顯著降低(P<0.05)，SOD活性差異無統計學意義(P>0.05,表5)。

討 論

心律失常是心肌缺血再灌注損傷的主要表現形式之一，以室性心動過速(VT)、心室顫動(VF)等較為多見，此外還有心房顫動、房室傳導阻滯等，并且心律失常是急性心肌梗死再灌注后死亡的主要原因之一[11～13]。維拉帕米是一種鈣離子拮抗劑，是臨床上治療心律失常的一線用藥[9]。本實驗選擇維拉帕米作為陽性對照藥物。

表5 各組大鼠心肌組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量

與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，ΔP<0.01；與維拉帕米組比較，▲P<0.05

水飛薊賓(Silibinin，SIL)是一種表現出多種生物學活性的水飛薊素，本研究通過制備大鼠心肌缺血再灌注性心律失常模型并于造模前7天給予SIL進行預處理，研究發現經SIL預處理能夠改善缺血再灌注性心律失常大鼠心律失常狀況，表現為延長心電圖PR、QRS間期并降低ST段抬高程度，降低VT、VF發生率，降低心律失常評分，說明SIL具有抑制或緩解心肌缺血再灌注所致心律失常風險的作用，并且該作用呈一定的劑量相關性。

能量代謝障礙是心肌缺血再灌注損傷的重要病理機制，ATP合成受阻將導致依賴ATP的Ca2+-Mg2+ATPase活力降低，使細胞內Ca2+泵出能力下降，導致心肌細胞Ca2+超載進而引發心律失常[10,14，15]。氧化應激損傷和能量耗竭將導致Na+-K+ATPase活力進一步降低，進而使細胞外K+增多，導致缺血中央至邊緣區K+含量逐漸下降的不均勻分布態勢，這也是導致心律失常的重要原因之一[16]。本研究結果顯示，經SIL預處理能夠明顯改善缺血再灌注性心律失常大鼠心肌組織Ca2+-Mg2+ATPase、Na+-K+ATPase活力并降低心肌細胞Ca2+含量，改善SOD、GSH-Px活性并降低氧化應激損傷，SIL上述作用呈現一定的劑量相關性，這可能是SIL能夠抑制心肌缺血再灌注后發生心律失常的重要分子機制。

NO具有調節冠狀動脈血流量、改善缺血心肌細胞灌流而減輕室性心律失常的生理學作用，并且能夠通過降低心肌收縮力、減少心肌耗氧量，從而提高心肌細胞氧供/需比[17]。NOS是機體內促進NO生產的酶。本研究發現，經SIL預處理能夠改善NOS活性并提高NO含量，并且隨著SIL劑量升高，上述作用增強，這可能也是SIL抑制心肌缺血再灌注性心律失常的機制之一。

綜上所述，SIL對大鼠心肌缺血再灌注所致心律失常具有一定的劑量相關性保護作用，可能與SIL能夠改善ATPase活性、降低心肌細胞Ca2+濃度、提高NO含量、抑制氧化應激等有關。