強筋祛濕液藥效學研究

鄭立肯 葉世蕓 殷少文 孫濟平 王維

【摘 要】目的：研究院內制劑強筋祛濕液藥效與安全性，以期為保證其臨床應用安全與闡明藥效提供科學依據。方法：最大給藥量法考察強筋祛濕液家兔皮膚涂抹急性毒性;建立二甲苯致小鼠急性耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型與佐劑性關節炎大鼠模型，觀察強筋祛濕液對實驗動物炎癥反應的抑制作用;采用熱板法觀察強筋祛濕液對小鼠熱板疼痛反應的影響。結果：急性毒性試驗結果表明強筋祛濕液1日內最大給藥量給藥未見由藥物引起的毒性反應;藥效學表明強筋祛濕液對二甲苯所致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足跖腫脹與佐劑致大鼠關節炎的炎癥反應具有顯著的抑制作用（P<0.05），顯著下調佐劑性關節炎大鼠血清中IL-6和TNF -α的水平（P<0.05），對熱板所致的非特異性疼痛具有一定抑制作用（P<0.05）。結論：強筋祛濕液安全性較好，具有明顯的抗炎和鎮痛作用，可減輕滑膜增生、脂肪組織和滑膜上皮細胞增生、減少多種炎細胞浸潤等多種病理學改變，且該作用與藥物調節血清中IL-6和TNF-α水平有關。

【關鍵詞】強筋祛濕液;急性毒性;抗炎;鎮痛;藥效學

【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）20-0026-06

Abstract：Objective To provide a scientific basis for ensuring the safety of clinical application and elucidating the efficacy of Qiangjin Qushi liquid.Methods Study on acute toxicity of skin smear on rabbits with Qiangjin Qushi liquid by maximum dose method; The acute ear swelling in mice induced by xylene， paw swelling in rats induced by carrageenan and adjuvant arthritis in rats were established to observe the inhibitory effect of Qiangjin Qushi liquid on inflammatory reaction in experimental animals; and the effect of Qiangjin Qushi liquid on hot plate pain response in mice was observed by hot plate method.Results The acute toxicity test showed that the maximum dose of Qiangjin Qushi liquid in one day had no toxic reaction caused by drugs. Pharmacodynamics showed that Qiangjin Qushi liquid had significant inhibitory effects on xylene-induced ear swelling in mice， carrageenan-induced paw swelling in rats and adjuvant-induced arthritis in rats （P< 0.05）， and significantly decreased the serum level of adjuvant-induced arthritis in rats. The levels of IL-6 and TNF-alpha （P< 0.05） inhibited the non-specific pain induced by hot plate （P< 0.05）.Conclusion Qiangjin Qushi liquid is safe and has good anti-inflammatory and analgesic effects. It can alleviate many pathological changes such as synovial hyperplasia， adipose tissue and synovial epithelial cell proliferation， and reduce a variety of inflammatory cell infiltration. This effect is related to the drug regulation of serum levels of IL-6 and TNF-α.

Keywords：Qiangjin Qushi liquid;Acute toxicity; Anti-inflammatory; Analgesia;Pharmacodynamics

痹者，閉也。《素問·痹證》中記載：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也”[1]，早在《黃帝內經》中就有收錄運用“醪酒”治療痹證[2]。中醫理論下由邪氣侵犯人體肌表經絡引起的痛痹、行痹、著（濕）痹等合稱為“痹證”，以筋骨肌肉酸脹疼痛、麻痹、沉重甚至關節腫脹變形等為主要臨床表現。現代醫學中所認為的慢性自身免疫性疾病，如風濕關節炎、類風濕關節炎、風濕多肌痛、風濕熱、神經痛等關節炎癥與疾病均屬于“痹證”范疇[3]。常規治療風濕病癥的藥物有非甾體消炎止痛藥、糖皮質激素、改善風濕病情藥物（DMARDs）和α腫瘤壞死因子（TNF-α）抑制劑等新型生物制劑[4-5]，除單用常規合成藥外，亦采用csDMARD三聯療法（向甲氨蝶呤中加入羥氯喹和柳氮磺胺吡啶）、MTX-TNFi（甲氨蝶呤加入腫瘤壞死因子α抑制劑）聯合治療[6]，上述藥物除易產生藥物依賴性外亦可能引起心血管疾病、骨質疏松以及高血壓等不良反應[7-8]。中醫治療痹證常辨明風寒濕熱，疾病新久，區分標本虛實方進行扶正、祛邪、通絡等治療[9]，以補虛藥、祛風濕藥、解表藥、活血化瘀藥等相互配伍使用[10]，配合針灸、敷貼等外治法[11]或同生物制劑聯合使用，綜合治療達到良好的治療效果。

強筋祛濕液為貴州中醫藥大學孫濟平教授的經驗方，該方中含有防己、川牛膝、尋骨風等三十余味藥材，以祛風除濕、活血化瘀為主要功效，臨床上常用于治療風濕關節痛、關節腫脹，皮下損傷瘀血，皮膚擦傷潰破等。在前期研究基礎上，已初步建立強筋祛濕液質量標準，現從強筋祛濕液對抗炎、消腫、鎮痛方面進行主要藥效學與急性給藥毒性研究，以期為強筋祛濕液臨床應用提供依據，并為后續深入研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 試劑與藥品 二甲苯（批號：20140908，重慶茂業化學試劑有限公司）;2，4-二硝基氯苯（批號：T20150905，西亞試劑）;完全弗氏佐劑（批號：F58810nl;USA）;強筋祛濕液（批號：20150501，貴州中醫藥大學實驗中心）;消腫止痛酊（批號：20150302，廣西壯族自治區花紅藥業股份有限公司）。

1.2 實驗動物 KM小鼠，SPF級，體重18～22 g，雌性，購于長沙天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK（湘）2014-0011;SD大鼠，SPF級，體重180～220g，雄性，購于長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2014-0011;家兔，Ⅰ級實驗動物，體重2.1～2.5kg，雌雄各半，購于貴州醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（黔）2012-0001。

1.3 儀器 MNT50游標卡尺（上海美耐特實業有限公司）;AB204-S分析天平（上海）;YLS-3E電子壓痛儀（濟南益延科技發展有限公司）;CT10R離心機（上海天美科學儀器有限公司）。

2 方法[2]

2.1 強筋祛濕液皮膚給藥急性毒性試驗 取健康家兔18只，雌雄各半，隨機分為3組，即空白組、溶媒組、強筋祛濕液組，每組6只。以背脊為中線脫除背部脊柱兩側毛，約160cm2（10cm×16cm），溫水擦洗，24h后檢查脫毛區域皮膚無損傷。各組受試家兔均按1.34g·kg-1皮膚涂抹給藥，24h后溫水洗去受試物，局部觀察家兔毒副反應情況。如試驗中出現死亡的家兔需進行解剖，記錄組織的顏色和體積改變等。

2.2 對二甲苯致急性耳腫脹小鼠模型消腫作用 健康小鼠隨機分為6組，每組12只：空白組、溶媒組、消腫止痛酊組、強筋祛濕液組（強筋祛濕液低、中、高劑量組給藥劑量按人體等效給藥量的5、10、20倍計算）。空白組給予生理鹽水10mL/kg、溶媒組給予同體積的溶劑，給藥組分別給予消腫止痛酊0.65g/kg、強筋祛濕液高、中、低劑量1.86，0.93，0.47g/kg涂于小鼠右耳廓0.2mL，每次間隔12h，連續給藥14d，于末次給藥后30min，每鼠右耳廓涂二甲苯0.1mL;1h后頸椎脫臼處死小鼠，打孔器取下左耳和右耳同一部位的圓片，稱重，計算耳廓腫脹度。公式如下：

腫脹度（mg）= 右耳片重-左耳片重

2.3 對角叉菜膠致足跖腫脹大鼠模型消腫作用 取SD大鼠60只，雄性，按體重隨機分為6組，即空白組、溶媒組、消腫止痛酊組、強筋祛濕液組（強筋祛濕液低、中、高劑量組給藥劑量按人體等效給藥量的3.5、7、14倍計算），每組10只。空白組給予同體積生理鹽水，給藥組分別給予消腫止痛酊0.46g/kg、強筋祛濕液高、中、低劑量1.30，0.65，0.33g/kg涂于右后足跖，每次給藥間隔12h，連續給藥14d。末次給藥后0.5h分別于大鼠右后足跖皮內注射1%角叉菜膠混懸液0.1mL/只致炎;末次給藥前和給藥后2、3、4、5、6、8h分別用游標卡尺測右后足跖厚度，計算足跖腫脹率。

2.4 對佐劑性關節炎大鼠模型消炎作用 取SD大鼠70只，雄性，180～220g，按體重隨機分為7組：空白組、模型組、溶媒組、消腫止痛酊組、強筋祛濕液低、中、高劑量組，游標卡尺測定右后足跖厚度。空白組右后足跖皮內注射生理鹽水10mL/kg，其余6組右后足跖皮內注射完全弗氏佐劑0.1mL致炎。次日，空白組和模型組于生理鹽水涂抹于足跖，溶媒組涂抹同體積的高粱酒，其余4組分別給消腫止痛酊0.46g/kg、強筋祛濕液高、中、低劑量1.3，0.65，0.33g/kg，藥液涂于右側足跖。每天間隔12h，連續給藥13d。

觀察指標：測量致炎第1天、第7天和第13天右后足跖腫脹度和壓痛值。給藥第14天，取股動脈取血5mL，3000r/min離心15min，離心后取血清-20℃冷藏，采用IL-6和TNF-α定量酶聯檢測放射免疫試劑盒檢測血清中白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF -α）炎癥因子;取關節滑膜HE染色病理檢測。

2.5 對小鼠熱板疼痛反應的影響 每次取1只18～22g雌性小鼠放在已預熱10min（55±0.5 ℃）的熱板上，自放在熱板上至出現舔后足所需時間（秒）作該鼠的痛閾值。選擇痛閾值范圍為5～30s的小鼠。將合格小鼠隨機分為6組，每組12只分為：空白組、溶媒組、消腫止痛酊組、強筋祛濕液低、中、高劑量組（強筋祛濕液低、中、高劑量組給藥劑量按人體等效給藥量的5倍、10倍、20倍計算），分別給生理鹽水10mL/kg、高粱酒10mL/kg、消腫止痛酊0.65g/kg、強筋祛濕液高、中、低劑量1.86、0.93、0.47g/kg藥液涂于雙后足跖，每次給藥間隔12h，連續給藥14d。末次給藥后2h 用熱板法測痛閾值，計算痛閾變化率;在測試中如60s仍無反應，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60s計算。

2.6 統計學分析 使用SPSS軟件22.0版本進行數據分析，計量資料以（x±s）表示，組間均數比較用t檢驗，差異具有統計學意義（P<0.05）。

3 結果

3.1 強筋祛濕液皮膚給藥急性毒性試驗 由表1、2可知，給藥后觀察14d，期間動物未出現中毒及死亡，用溫水洗去皮膚上的受試物，未觀察到皮膚紅斑、水腫等反應。給藥期間動物體重均有增長，給藥組、溶媒組與空白組統計無統計學差異（P<0.05）。

3.2 對二甲苯至急性耳腫脹小鼠模型消腫作用 致炎后，各組小鼠右耳高度紅腫。與空白組比較，消腫止痛酊組與強筋祛濕液低、中、高劑量組給藥后腫脹度顯著低于空白組，而溶媒組無明顯差異。表明強筋祛濕液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹具有抑制作用，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3.3 對角叉菜膠致足跖腫脹大鼠模型消腫作用 由表4可知，同空白組比較，注射角叉菜膠后測量所有組別大鼠足趾腫脹率減弱，同時消腫止痛酊組、強筋祛濕液各劑量組大鼠足趾腫與空白組比較有明顯差異。表明強筋祛濕液對角叉菜膠致大鼠的足趾腫脹具有抑制作用。

3.4 對佐劑性關節炎大鼠模型消炎作用 由表5可知，在連續給藥7d至13d后，消腫止痛酊組與強筋祛濕液藥酒的高、中、低劑量組在致炎后大鼠的足趾腫脹度減弱，與模型組比較有明顯差異。繼續給藥至第13天后，陽性對照藥物消腫止痛酊與強筋祛濕液的低、中、高劑量組在致炎后大鼠的足趾壓痛值提高，并存在統計學差異（P<0.05），而溶媒組仍無統計學差異（P>0.05），說明強筋祛濕液可有效減輕炎癥同時消腫止痛。由圖1可知，造模14 d佐劑性關節炎模型組大鼠血清中TNF -α、IL-6的濃度顯著性增加，消腫止痛酊組和強筋祛濕液組可顯著性降低TNF -α、IL-6的濃度。

由圖2可知，處死實驗大鼠，取右后肢關節滑膜固定于10%的甲醛溶液中，脫鈣后常規石蠟包埋，切片并HE染色后，空白組滑膜上皮細胞形態正常，呈單層排列，滑膜細胞無水腫;模型組滑膜上皮細胞嚴重增生，滑膜細胞水腫明顯，大量炎性細胞浸潤;消腫止痛酊組滑膜上皮細胞輕微增生，滑膜細胞水腫不明顯;強筋祛濕液組滑膜上皮細胞少量增生，滑膜下見少量炎性細胞浸潤，滑膜細胞輕度水腫。表明強筋祛濕液對佐劑致大鼠關節炎病變有明顯改善作用。

3.5 對小鼠熱板疼痛反應的影響 由圖3可知，在不同時間內的痛域值有顯著性差異，各個藥物組之間的痛域值差異有顯著性意義。與空白對照組相比較，消腫止痛酊組、強筋祛濕液低、中、高劑量組的痛域值呈現上升趨勢，在第14天時，痛域值具有顯著性差異，表明強筋祛濕液對熱板所致的非特異性疼痛具有一定抑制作用。

4 討論

強筋祛濕液由防己、川牛膝、杜仲、紅花等35味中藥制備而成，主藥防己稱為“祛風濕要藥”，有效成分粉防己堿用于治療水腫、風濕性疾病和炎性疾病[13]，研究表明粉防己堿可通過抑制NF-κB/ COX-2通路有效降低RA大鼠血清中TNF-α，IL-1β和IL-6的濃度[14-15]，通過依賴芳烴受體（AhR）相互調節STAT3和STAT5活性[16]以恢復Th17/ Treg平衡發揮其抗關節炎功效[17]。川牛膝甾酮類化合物、杜仲提取物等亦可減少促炎細胞因子與環氧合酶-2的分泌，改善軟骨代謝保護關節軟骨[18-20]。因此，實驗以足跖腫脹度、TNF -α、IL-6以及痛閾值為指標，對強筋祛濕液鎮痛抗炎活性進行評價，為其臨床用藥的有效性提供實驗依據。

本實驗急性毒性試驗顯示，家兔給予強筋祛濕液后未出現皮膚紅斑、水腫等反應，提示強筋祛濕液安全性良好;從抗炎、鎮痛以及對大鼠佐劑關節炎模型等方面評價了強筋祛濕液的藥理作用，結果表明其可有效抑制炎癥并增加受試動物痛閾值。強筋祛濕液對二甲苯致小鼠耳廓腫脹、對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹具有不同程度的抑制作用，給藥后3 h高劑量組大鼠足趾腫脹率減弱，同空白組比較出現明顯差異，表明強筋祛濕液具有抗炎作用。給藥組在不同時間內痛域值呈現上升趨勢，表明強筋祛濕液對熱板所致的非特異性疼痛具有一定抑制作用。同時，強筋祛濕液可顯著性降低佐劑性關節炎模型組大鼠血清中IL-6和TNF–α的濃度與水平，提示強筋祛濕液抗類風濕的機理或與調節炎性細胞因子有關。各組大鼠關節滑膜經HE染色后結果表明強筋祛濕液對佐劑致大鼠關節炎病變有明顯改善作用。

綜上所述，強筋祛濕液對完全佐劑、對角叉菜膠所導致足趾腫脹度與二甲苯致小鼠耳廓腫脹具有極顯著的抑制作用，急性毒性試驗結果顯示安全性較好，且對皮膚無明顯皮膚過敏反應，可顯著下調佐劑關節炎模型血清中炎性細胞因子水平，顯著提高痛閾值。故強筋祛濕液對于痹證有良好的作用效果，作為院內制劑具有良好的開發價值和應用前景。

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（收稿日期：2019-07-20 編輯：陶希睿）