當歸調經顆粒（無糖型）的質量標準研究

唐靖雯 盧禮平 李嬌嬌 楊桃 潘梅

【摘 要】目的：建立當歸調經顆粒（無糖型）的質量標準，有效地控制產品質量。方法：采用薄層色譜法對制劑中當歸、川芎、甘草、黃芪、白芍進行定性鑒別，以白芍中芍藥苷作為指標性成分，采用高效液相色譜法測定其含量。色譜柱為Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（12∶ 88），流速為1.0mL/min，檢測波長為230 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為10μL。結果：當歸、川芎、甘草、黃芪、白芍的TLC法鑒別專屬性強，且陰性均無干擾;含量測定結果顯示，芍藥苷濃度在（4.38～140.16）μg/mL內與峰面積呈良好的線性關系（r=0.9998），平均加樣回收率為99.45%，RSD=1.97%（n=6）。結論：該方法操作簡單、結果準確、專屬性強、重復性好，可用于當歸調經顆粒（無糖型）的質量控制。

【關鍵詞】當歸調經顆粒（無糖型）;質量標準;薄層色譜法;高效液相色譜法

【中圖分類號】R284【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2019）20-0040-05

Abstract：Objective The quality standard of Angelica regulating granule （sugar-free type） was established to effectively control the quality of products.Methods TLC was used to identify the radix angelicae sinensis， rhizoma chuanxiong， radix glycyrrhiza root， radix astragalus root and radix paeoniae alba. The content of paeoniflorin in radix paeoniae alba was determined by HPLC. The column was Agilent TC-C18（250 mm×4.6mm，5μm）， the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （12∶ 88， V/V）， the flow rate was 1.0mL/min， the detection wavelength was 230nm， the column temperature was 25℃， and the injection volume was 10μL.Results The TLC method of angelica sinensis， ligusticum chuanxiong， licorice root， astragalus root and paeoniae alba has strong specificity and no interference. The results showed that the concentration of paeoniflorin in （4.38 ～ 140.16）μg/mL had a good linear relationship with the peak area （r=0.9998）， and the average recovery rate was 99.45%， RSD=1.97% （n=6）.Conclusions The method is simple， accurate， specific and repeatable， and can be used for the quality control of Angelica regulating granule （sugar-free type）.

Keywords：Angelica regulating granule（sugar-free type）;Quality standards;TLC;HPLC

當歸調經顆粒由當歸、熟地黃、川芎、黨參、白芍、甘草、黃芪等7味藥材組成，收載入《中國藥典》2015年版。具有補血助氣、調經的功效，用于貧血衰弱、病后、產后血虛以及月經不調、痛經。本研究在當歸調經顆粒含糖型基礎上，完成了其無糖型產品的質量標準研究并建立了企業內控質量標準，為廣大患者提供了一個治療痛經的產品。為保證臨床用藥的安全、有效以及更好地控制產品質量，本研究采用薄層色譜法對制劑中當歸、川芎、甘草、黃芪、白芍等5味藥材進行定性鑒別;建立了以制劑中白芍的主要活性成分芍藥苷為指標性成分的HPLC含量測定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器、ChemStation色譜工作站、1200型自動進樣器（美國Agilent公司）;AG135型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）;CH-250型超聲波清洗機（天津恒奧科技公司，功率：250W，頻率：40KHz）;硅膠G（青島海洋化工廠分廠，批號：20150701）。

1.2 藥品與試劑 無糖型當歸調經顆粒（批號：170501、170502、170503，貴州威門藥業股份有限公司）;芍藥苷對照品（批號：110736-201741，中國食品藥品檢定研究院）;磷酸（批號：10015408，國藥集團化學試劑有限公司）;乙腈為色譜純;乙酸乙酯、三氯甲烷、冰醋酸、環己烷、無水乙醇均為分析純;水為超純水。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 當歸、川芎的鑒別 取本品10 g，研細，加水30 mL使溶解，用乙醚振搖提取2次（水液備用），每次使用20mL，將兩次乙醚提取液合并，揮干乙醚提取液，殘渣加lmL甲醇使完全溶解，作為供試品溶液。分別取當歸、川芎藥材，按照供試品溶液的制備方法分別制成當歸、川芎對照藥材溶液。另按制劑的處方比例稱取適量缺當歸、川芎藥材的其他各味藥材，按該制劑的制備工藝制成顆粒，取顆粒適量，按上述制備供試品溶液的操作方法制成缺當歸、川芎藥材的陰性樣品。照薄層色譜法（2015年版中國藥典四部，通則0502），分別依次吸取上述當歸對照藥材、川芎對照藥材、陰性樣品、供試品溶液各4μL，分別依次點于同一硅膠G薄層板，選用正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶ 1∶ 1∶ 0.1）的溶液為展開劑進行展開，取出硅膠板后放置晾干，將晾干的硅膠G薄層板置紫外光燈（365nm）下檢視。結果，當歸的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現的斑點完全一致，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性無干擾。如圖1所示。

2.1.2 甘草的鑒別 取本品10g，研細，加乙醚40mL，超聲處理30min，濾過，棄去乙醚液，殘渣揮干乙醚，加水40mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20mL，分取正丁醇液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇lmL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草藥材及缺甘草的陰性樣品適量，按上述供試品溶液的制備方法分別制成甘草對照藥材溶液、缺甘草的陰性樣品溶液。照薄層色譜法（2015年版中國藥典四部，通則0502），分別吸取上述甘草對照藥材、陰性樣品、供試品溶液各6μL，分別依次點于同一硅膠G薄層板，選用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶ 1∶ 1∶ 2）的溶液為展開劑進行展開，取出硅膠板后放置晾干，將晾干的硅膠G薄層板置紫外光燈（365nm）下檢視。結果，當歸的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現的斑點完全一致，且陰性無干擾。如圖2所示。2.1.3 黃芪的鑒別 取“2.1.1”項下的備用水溶液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次20mL，分取正丁醇液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇l mL使溶解，作為供試品溶液。取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每lmL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。另取缺黃芪的陰性樣品適量，按上述供試品溶液的制備方法制成缺黃芪的陰性樣品溶液。照薄層色譜法（2015年版中國藥典四部，通則0502），分別吸取上述黃芪苷對照品、陰性樣品、供試品溶液各6μL，分別依次點于同一硅膠G薄層板，選用三氯甲烷-甲醇-水（13∶ 7∶ 2）的下層溶液作為展開劑，取出硅膠板后放置晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別在日光及紫外光（365nm）下檢視。結果，黃芪的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現的斑點完全一致，日光下顯相同顏色的斑點，紫外光下顯相同顏色的熒光斑點，且陰性無干擾。如圖3、圖4所示。

2.1.4 白芍的鑒別 取本品10g，加乙醇10mL，振搖5min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇lmL使溶解，作為供試品溶液。取芍藥苷對照品，加乙醇制成每lmL含lmg 的溶液，作為對照品溶液。另取缺白芍的陰性樣品適量，按上述供試品溶液的制備方法制成缺白芍的陰性樣品溶液。照薄層色譜法（2015年版中國藥典四部，通則0502），分別吸取上述芍藥苷對照品、陰性樣品、供試品各10μL，分別依次點于同一硅膠薄層板，選用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶ 5∶ 10∶ 0.2）為展開劑進行展開，取出硅膠板后放置晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果，白芍的TLC圖中，不同批次供試品溶液所呈現的斑點完全一致，與芍藥苷對照品相應的位置上，顯相同的斑點，且陰性無干擾。如圖5所示。

2.2 芍藥苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm）;乙腈-0.1%磷酸溶液（12∶ 88，V/V）;流速：1.0mL/min;檢測波長：230nm;柱溫：25℃;進樣量：10μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 供試品溶液[2] 取裝量差異項下的本品，研細，從中取約2.5 g藥物粉末，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇10 mL使溶解，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.2.2 對照品溶液 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成每1 mL含35 μg的溶液，既得。

2.2.2.3 缺白芍的陰性樣品 按處方稱取缺白芍的群藥，按上述供試品溶液的制備方法制成缺白芍的陰性樣品溶液。

2.2.3 系統適用性試驗[3-5] 精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液、供試品溶液、缺白芍的陰性樣品溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定。理論板數按芍藥苷峰計算>3000，分離度>1.5。色譜如圖6所示。

2.2.4 線性關系 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋制成0.2192mg/mL的溶液，分別精密量取0.5、1、2、4、8、16μL至25mL的容量瓶中，加甲醇稀釋刻度。按“2.2.1”項下色譜條件，各進樣10μL，記錄峰面積，以各對照品溶液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸。回歸方程：A= 14.254C-25.694，r=0.9998。結果表明，對照品溶液濃度在（4.38～140.16）μg/mL范圍內，與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 取樣品（批號170501），按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，精密吸取10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄芍藥苷的峰面積。結果，峰面積RSD為0.28%，表明儀器精密度較好。

2.2.6 穩定性試驗 取樣品（批號170501），按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10h進樣測定記錄色譜峰。結果，峰面積的RSD為1.72%，表明供試品溶液在10h內穩定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批樣品（批號170501）6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，以外標一點法計算芍藥苷的含量。結果，含量的RSD為1.96%，表明本方法的重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知芍藥苷含量的當歸調經顆粒（無糖型，批號：170501，含量為0.3427mg/g），采用加樣回收法，測定本方法的回收率。精密稱取本批次當歸調經顆粒1.25g，分別精密吸取芍藥苷對照品溶液（35.20μg/mL）10 mL，按“2.2.2”項下的方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，計算白芍苷的加樣回收率，結果詳見表1。

2.2.9 樣品含量的測定 取3批樣品（批號170501、170502、170503）各適量，按 “2.2.2”項下方法制成供試品溶液，精密吸取10 μL注入HPLC儀，按“2.2.1”項下色譜條件記錄色譜圖;另取“2.2.2”項下對照品溶液，同法測定。按外標法以峰面積計算供試品的含量，結果詳見表2。

3 討論

研究對制劑中當歸、川芎進行TLC 定性鑒別時，按照文獻方法：分別用正己烷-乙酸乙酯（9∶ 1）、正己烷-乙酸乙酯（4∶ 1）作為展開劑進行TLC定性鑒別，結果供試品色譜中均未顯示斑點。在多次嘗試的基礎下發現，以兩種溶劑作為展開劑時始終無法獲得理想的展開效果，故最終選擇采用正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶ 1∶ 1∶ 0.1）的4種溶劑作為展開劑，所得的供試品色譜中斑點也較為清晰。

制劑中當歸、白芍的主要活性成分分別為阿魏酸、芍藥苷，在含量測定的指標性成分如何選取過程中，考慮到君藥當歸中阿魏酸含量較低，故選擇含量較高、成分較穩定的活性成分芍藥苷作為指標性成分，采用高效液相色譜法測定白芍中芍藥苷的含量。但由于中藥制劑成分復雜且該制劑中白芍所占比例小等因素，僅以白芍中芍藥苷作為指標性成分來控制該制劑質量明顯不足，因此在后續的研究中，應優化臣藥中阿魏酸的提取方法，增加制劑中阿魏酸提取量，建立多指標性成分的含量測定方法，以更有效地控制該制劑的質量。

綜上，本研究建立的質量控制分析方法，經過對多批產品的驗證，結果表明該質量控制方法簡便、準確，可用于當歸調經顆粒（無糖型）生產過程質量控制，能有效地保證產品臨床用藥的安全性、有效性和可控性。

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（收稿日期：2019-08-29 編輯：陶希睿）