GRP78-ATF6-CHOP通路相關分子在葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎中的表達

郭騰飛，軒青霞，吳玉丹，董仕楨，高 磊，陳 攀，常永超，高 強

1)河南科技大學臨床醫學院；河南科技大學第一附屬醫院消化內科 河南洛陽 471003 2)河南科技大學臨床醫學院；河南科技大學第一附屬醫院檢驗科 河南洛陽 471003 3)首都醫科大學附屬北京康復醫院消化內科 北京 100144

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組反復發作的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)，近年來在我國其發病率呈上升趨勢[1]。IBD的病因和發病機制尚未明確，目前認為IBD是一種多因素相互作用的腸道障礙性疾病，包括遺傳因素、宿主免疫反應、腸道菌群、環境因素等[1-2]。內質網是膜型及分泌型蛋白質合成及折疊的主要場所，此外也可參與脂質合成、能量代謝以及細胞內Ca2+的貯存和釋放等，是真核細胞內重要的細胞器。當細胞內環境發生改變，導致未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網管腔內發生堆積，便會誘發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，從而產生一系列的細胞自我保護性反應，統稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)。ERS可通過3條信號通路激活UPR，分別為活化轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)、蛋白激酶RNA樣內質網激酶[protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase，PERK]、肌醇需求酶1 (inositol requiring enzyme 1，IRE1)[2-4]。ERS與多種人類疾病相關，在IBD的發展過程中起著重要的作用[5]。ATF6屬于Ⅱ型膜轉運蛋白，正常情況下與葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein of 78 kDa, GRP78)結合處于未激活狀態。當發生ERS時，GRP78與ATF6解離，從而激活ATF6通路[6]。ATF6可以影響C/EBP同源蛋白(CHOP)，CHOP參與細胞凋亡、增殖、分化以及細胞型特異性基因能量代謝相關過程的調控[7]。本研究應用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導小鼠急性腸炎模型，通過對GRP78、IRE1α、PERK、ATF6、CHOP等表達情況的檢測，探討GRP78-ATF6-CHOP通路與小鼠結腸炎之間的關系，以期為IBD發病機制的研究及治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物6～8周齡、體重為19～25 g的健康清潔級雄性129S1/SvJ種系小鼠(購自深圳大學醫學部)飼養于河南科技大學第一附屬醫院開元院區動物實驗中心，室內燈光明暗交替周期設置為12 h，維持濕度在50%左右，室內溫度在20～22 ℃，給予小鼠足量SPF級混合配方飼料(北京華阜康生物公司)，小鼠自由飲水，并每日定時更換新鮮飲水，保持小鼠生活環境清潔衛生及通風良好。每日觀察小鼠的攝食飲水量、大便性狀及活動情況，確認小鼠健康且適應環境。

1.2主要試劑DSS購自美國MP Biomedicals 公司，相對分子質量為36 000～50 000；GRP78(ab21685)、ATF6(ab37149)和CHOP(ab11419)抗體均購自美國Abcam 公司；GAPDH(sc-32233)抗體購自美國Santa Cruz公司；羊抗鼠(BA1054)、羊抗兔(BA1050)二抗、SABC即用型小鼠(SA1021)/兔(SA1022) IgG免疫組化試劑盒、ECL試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；大便隱血試劑盒購自珠海貝索生物技術有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；qRT-PCR擴增試劑盒和反轉錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程技術有限公司合成(表1)；DAB顯色試劑盒、中性樹脂購自北京索萊寶科技有限公司。

表1 引物序列和退火溫度

1.3結腸炎動物模型的建立及標本留取采用隨機數字表法將小鼠分為對照組和DSS組，每組8只。對照組飲用無菌蒸餾水，DSS組飲用30 g/L DSS溶液，自由飲用6 d。每組小鼠均給予充足SPF級混合飼料。第6天腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，處死，剪開腹腔取出全部結腸，觀察結腸性狀，并測量結腸長度；翻轉結腸，用預冷PBS清洗結腸內部糞便，自遠端剪取結腸組織約5 mm放入體積分數10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后4 μm厚切片，常溫保存以備HE及免疫組化染色使用；另外自遠端剪取約10 mm結腸組織，立即放入RNAlater中，4 ℃放置24 h后，轉移至-80 ℃冰箱保存，備mRNA檢測使用；再剪取約10 mm結腸組織，液氮冷凍后轉至-80 ℃冰箱保存，備Western blot檢測使用。

1.4觀測指標及組織病理學評分動物模型建立期間每日上午及下午觀察小鼠，觀察指標：反應機警性、活動情況、毛發光澤度、大便性狀和大便帶血情況，稱量小鼠的進食量以及飲水量，運用隱血檢測試劑盒檢測大便隱血情況，下午4點準時稱量體重。按照Jackson等[8]方法進行DAI評分，DAI評分標準：根據小鼠大便性狀(正常、松散、稀便)、大便帶血情況(正常、隱血陽性、肉眼血便)及體重下降百分比3項指標分別進行評分，然后取三者平均值即為DAI評分結果。小鼠結腸組織切片行HE染色，在400倍光鏡下觀察，按照 Esworthy等[9]評分標準進行組織病理學評分，炎癥的臨界值定義為6分。

1.5小鼠結腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、GRP78、IRE1α、PERK、ATF6和CHOP mRNA的qRT-PCR檢測使用Trizol法提取小鼠結腸組織總RNA，運用核酸定量儀測定RNA濃度與純度。取2 μg總RNA行反轉錄合成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存備用。冰上配制25 μL PCR反應體系：cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，DNase/RNase-free水8.5 μL，SYBR Premix EX Taq Ⅱ (2×) 12.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s； 95 ℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計40個循環。每個樣本做3個復孔，以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt法分析各項指標mRNA相對表達量。

1.6小鼠結腸組織中GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達的檢測

1.6.1 免疫組化法 結腸組織切片經常規乙醇梯度脫蠟后行染色，一抗GRP78(兔多克隆抗體)、ATF6(兔多克隆抗體)、CHOP(鼠單克隆抗體)分別按1∶1 000、1∶300、1∶200稀釋，以PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃冰箱過夜后，滴加相應二抗，DAB顯色，蘇木精復染。顯微鏡下觀察，每張切片選擇10個視野(×200)，每個視野計數100個細胞。參考文獻[10]的方法對GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達情況進行評分。

1.6.2 Western blot 取約50 mg小鼠結腸組織于EP管中，加入1 mL RIPA裂解液勻漿后置于冰上30 min，4 ℃離心后取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。與蛋白上樣緩沖液充分混勻后，100 ℃變性10 min，取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉液封閉1 h。GRP78、ATF6、CHOP一抗均按1∶1 000稀釋，4 ℃過夜，二抗(1∶2 000)室溫2 h。ECL顯色3 min，經成像系統成像，用Image J軟件進行灰度分析，以目的蛋白與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.7統計學處理采用SPSS 19.0進行數據分析，應用兩獨立樣本t檢驗比較兩組小鼠第6天體重變化、DAI評分、結腸長度、組織病理學評分、炎癥因子、GRP78、ATF6、CHOP mRNA及蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1小鼠一般狀況、DAI評分、結腸組織病理學評分的比較對照組小鼠活動自如，體毛光澤，攝食飲水正常，生長發育良好，體重增加。DSS組于造模第3天開始出現體毛凌亂，活動量減少，攝食量及飲水量減少，小鼠肛周潮濕明顯并出現稀便、大便隱血陽性等現象；第6天全部小鼠出現嚴重肉眼血便，體重下降約15%。與對照組相比，第6天DSS組DAI評分(3.8±0.3)增高，結腸長度縮短(P<0.05)。HE染色可見對照組小鼠結腸黏膜結構完整，無炎性細胞浸潤(圖1A1)；DSS組可見黏膜上皮細胞廣泛缺失，腺體多數不完整，杯狀細胞缺失，黏膜及黏膜下層細胞排列紊亂，炎性細胞廣泛浸潤，呈嚴重炎癥改變(圖1B1)；與對照組相比，DSS組組織病理學評分顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 兩組小鼠第6天體重變化、DAI、結腸長度、組織病理學評分比較

A：對照組；B：DSS組；1：HE染色；2：GRP78蛋白；3：ATF6蛋白；4：CHOP蛋白

2.2小鼠結腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、GRP78、IRE1α、PERK、ATF6和CHOP mRNA表達的比較見表3。由表3可知，與對照組相比，IL-1β、IL-6、TNF-α、GRP78、ATF6和CHOP mRNA表達水平在DSS組顯著增高(P<0.05)。

表3 兩組小鼠結腸組織炎癥因子和ERS相關分子mRNA的表達

*:DSS組與對照組相比

2.3兩組小鼠結腸組織中GRP78、ATF6和CHOP蛋白的表達見圖1。GRP78蛋白主要表達于上皮細胞胞質和胞膜。ATF6蛋白主要表達于上皮細胞胞質及胞核，也可表達于刷狀緣；CHOP蛋白主要表達于結腸上皮細胞的胞核中。DSS組3種蛋白的表達較對照組明顯上調(表4)。

表4 兩組小鼠結腸組織中GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達情況

3 討論

IBD在西方國家屬于常見病，特別是北美、北歐、西歐、澳大利亞等地區和國家[11]。近年來隨著人們生活水平、生活環境、醫療環境等因素的改變，IBD在中國等亞洲低發病率國家的發病率呈逐年上升趨勢[11]。IBD主要表現為腹痛、腹瀉、黏液血便等癥狀，病程遷延不愈，發作與緩解交替，并可伴發多種腸道外癥狀及并發癥，嚴重影響患者的生活質量，增加患者經濟負擔[12-13]。本研究所建立的小鼠急性腸炎模型表現出腹瀉、黏液血便、體重下降等與人類結腸炎相似的臨床癥狀，病理組織學觀察可見小鼠結腸黏膜上皮細胞廣泛缺失，局部糜爛，腺體多數不完整，黏膜及黏膜下細胞結構排列紊亂，杯狀細胞消失，中性粒細胞等炎癥細胞廣泛浸潤，呈嚴重炎癥改變；炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA在炎癥組表達顯著升高。

GRP78在正常情況下可與IRE1、PERK、ATF6的管腔域結合，使后者處于非激活狀態；當發生ERS時，GRP78便與通路蛋白解離，使其處于激活狀態，因此，GRP78被認為是ERS發生的標志[14]。本研究中DSS組小鼠結腸組織中GRP78 mRNA和蛋白表達均明顯上調，與陳夢露等[10]的研究一致，說明本研究DSS誘導的小鼠結腸炎模型中ERS起到重要作用。

ATF6在維持組織穩態及正常發育過程中發揮著重要作用[15]。當發生ERS時，ATF6與GRP78解離，并轉運至高爾基復合體，經蛋白水解酶1(site-1 protease, S1P)和S2P裂解，形成活化型ATF6，并轉運至細胞核，調節GRP78、GRP94、XBP1、CHOP等的表達，幫助蛋白質折疊、分泌和降解[15-16]。研究[17]顯示，ATF6通路在UC患者結腸上皮中被激活，表達上調。此外，Hanaoka等[18]研究顯示，ATF6在潰瘍性結腸炎相關直腸癌癌前不典型病變中表達上調。CHOP也稱GADD153或者DDIT3，正常情況下CHOP表達量很低，參與多種疾病的病理性凋亡過程，包括神經退行性疾病、代謝性疾病、缺血性疾病和腫瘤等[14,19]。當細胞發生ERS時，CHOP可通過多種途徑被激活從而誘導凋亡，如PERK-eIF2α-ATF4-CHOP、ATF6-CHOP等[14]。Xu等[20]的研究顯示ATF6-CHOP通路的激活在腦內出血的大鼠模型中可能發揮著重要的調節神經元細胞凋亡的作用。然而，在IBD病理過程中，激活CHOP引起凋亡的機制目前尚未明確。本研究顯示DSS組與對照組IRE1α和PERK mRNA表達水平差異無統計學意義，而DSS組ATF6和CHOP mRNA及蛋白均上調，說明CHOP在IBD腸道上皮細胞的凋亡過程中發揮了作用。

綜上所述，本研究結果顯示，GRP78-ATF6-CHOP通路的激活參與了IBD的發生發展，該研究結果可能為IBD的治療探索提供新的理論依據。