黃酒發酵菌株篩選、鑒定及應用

2019-12-03 02:13:02溫承坤李小強方尚玲陳茂彬

釀酒科技 2019年11期

陳孝，溫承坤，張玉，李小強，方尚玲，陳茂彬

(湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北省釀造工藝與裝備工程技術中心，湖北武漢 430068）

黃酒作為一種發酵酒，氨基態氮（氨基酸）含量是其中的一項重要指標。氨基酸是組成生命的重要元素，是人體不可或缺的物質，同時在代謝和信號傳導中發揮重要作用。人體有8種必需氨基酸不能合成，需要從外界食物中攝入。目前很多中小型廠家黃酒中氨基酸含量較低，不能夠達到標準中的最低值。黃酒中氨基酸主要來源于原材料中蛋白質的分解。本研究主要是為了增加黃酒發酵過程中蛋白質分解力，通過提高氨基酸含量來完善黃酒品質，提高營養價值[1]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：酒曲，主要來源于麻城、房縣和孝感等酒廠；大米和小麥。

試劑：Rnase、異丙醇、乙醇、SDS、無水乙醇、1X T（pH 8.0）、Folin試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、酪蛋白、酪氨酸溶液等。

儀器設備：電子分析天平、搖床、pH計、磁力攪拌器、滅菌鍋、培養箱、氣相色譜儀、糖度計、離心機、純水儀、電泳儀、研缽、酒精燈等。

1.2 培養基

②土豆培養基：土豆20%、葡萄糖2%、瓊脂2%。

③牛肉膏蛋白胨液體培養基(種子培養基)：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%。

復篩培養基：①發酵培養基：大米粉5%、葡萄糖1%、蛋白胨1%、硫酸鎂0.03%、氯化鈣0.1%、KH2PO40.5%、NaCl 0.5%。

鑒定培養基：①察氏培養基：蔗糖3%、硝酸鈉0.3%、七水硫酸鎂0.05%、氯化鉀0.05%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸亞鐵0.001%、瓊脂2%。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株篩選

1.3.1.1 預處理

將酒曲研磨成粉狀，準確稱取1 g加入裝有100 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中。加入滅菌的玻璃珠放入搖床，180 r/min振蕩30 min。取1 mL樣液并加入9 mL無菌生理鹽水，配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度菌懸液。

1.3.1.2 初級篩選

伴隨科學技術的不斷發展，為水輪發電機組容量的增大創造了良好的條件。水輪發電機組作為水電站最重要的設備，與水電站的經濟效益和社會效益密切相關。為了確保水輪發電機組安全穩定地運行，就必須對其配置進行可靠的保護。由于不同容量的水輪發電機組，其保護配置與特點不盡相同，但是無論怎么配置，都必須確保所配置保護動作可靠、經濟合理，最大程度降低水輪發電機組因故障造成的損害，提升機組運行的高效性、安全性，促進水電站實現最大化經濟效益。

將上述菌液涂布于牛奶培養基上，32℃恒溫2～5 d。觀察菌落周圍有無透明圈出現，并測量透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比。并將得到的菌株接種于土豆培養基上，培養2～3 d，甘油管保存備用[2]。

1.3.1.3 復篩

將得到的純種菌株接種于種子培養基中，以5%接種量轉接種子液于發酵培養基中，32℃培養5～7 d。發酵結束后按照GB/T 13662—2018測量發酵液中氨基態氮含量，同時測量蛋白酶酶活，挑選性質優良的菌株作為目的菌株[3]。

在pH3.0，40℃的條件下每分鐘水解酪蛋白產生1 g酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位(U/g)。

1.3.2 產酶曲線以5%接種量轉接種子液于發酵培養基中，180 r/min、30℃搖床培養，每隔24 h取5 mL菌液，按照斐林酚法測定酸性蛋白酶酶活，繪制不同時間下蛋白酶活曲線[4]。

1.3.3 菌種鑒定

將篩選得到的目的菌株編號為CX1，并進行菌種鑒定。

菌落菌株觀察：經過稀釋涂布、平板劃線、鏡檢，觀察到菌落形狀和菌株形態。

18s rRNA菌株鑒定：取培養基上的菌株于研缽，液氮研磨。將研磨好的菌轉移至1.5 mL離心管中，加入0.6 mL TE(pH 8.0)，攪勻，使菌體充分懸浮。加入250μL 10%SDS，倒轉混勻。加入3μL蛋白酶K(20 ng/μL)，輕輕混勻，37℃水浴1 h。加入150μL 5 mol/L NaCl，輕輕混勻。加入150μL 2%CTAB，輕輕混勻，65℃水浴20 min。12000 r/min常溫離心20 min。取上清液移至新的15 mL離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置30 min，12000 r/min，4℃離心10 min。棄上清液，在吸水紙上吸干液體，加750μL 70%vol乙醇，輕彈管壁，使沉淀懸浮并反復顛倒幾次，12000 r/min，4℃離心2 min。每管加入30μL純化水溶解沉淀(水中加Rnase,終濃度10 ng/μL)，用手輕彈管壁，4℃溶解過夜[5]。

目的菌株CX1利用18s引物(引物序列為ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'、ITS4；5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進行PCR擴增，利用常規PCR反應體系和程序進行實驗。得到的PCR產物交由華大基因進行測序鑒定。對于測序結果利用DNAMAN和Mega X構建NJ算法系統進化樹，最終確定菌株的進化地位。

1.3.4 毒理試驗

根據黃曲霉毒素在紫外光下發熒光，將分離得到的黃曲霉菌株接種在察氏培養基上，30℃培養5～7 d后，于360 nm紫外燈下觀測，有熒光斑點的菌株為產毒菌株，沒有則為不產毒菌株[6]。

1.3.5 菌種應用

1.3.5.1 酒曲制作

以小麥為主要原料，同時按照0%、10%、20%、30%、40%、50%麩皮添加量進行混合。取原料3%～4%（v/w）的種子液，用無菌水定容至30%（v/w），接入原料中混勻。32℃培養5～7 d后進行干燥處理。

1.3.5.2 發酵實驗

將得到的酒曲進行發酵實驗。

(1)選擇無蟲蛀、無霉變、無雜質的干凈大米按重量比1∶1.5～1∶2與水浸泡12～18 h，108℃下蒸煮20 min，取大米質量30～50%（v/w）的無菌水進行冷卻。

(2)稱取0.8%米飯質量的麥曲，充分混勻，待發酵5～7 d后，10000 r/min離心5 min取上清液，保存備用。

將得到的上清液進行理化實驗，檢測其總糖、氨基態氮含量。同時利用氣相色譜對其風味物質進行檢測[7-8]。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

將牛奶培養基篩選出來的菌株利用土豆培養基進行劃線純化，純化后的菌株編號為1、2、3、4、5、6，并進行發酵實驗，測定蛋白酶酶活（圖1-I）和氨基態氮含量（圖1-II）。得到目的菌株，命名為CX1，其初始酶活為95 U/mL，發酵產物中氨基態氮含量為1.1 g/L。

2.2 菌種鑒定

目的菌株CX1進行菌落（圖2左）與菌株（圖2右）形態觀察，初步鑒定為霉菌。

對目的菌株CX1進行測序鑒定，測序結果通過Blast進行比對。利用Mega X與DNAMAN進行系統進化樹的繪制（圖3），最終確定為Aspergillus flavus。

2.3 產酶曲線

每隔24 h取5 mL的CX1發酵液進行酶活檢測，圖4說明1 d時蛋白酶活力較低，為71 U/mL，4 d時蛋白酶活力達到最高值196 U/mL、7 d時酶活力下降為101 U/mL，發現其最佳產酶時間為4 d，此時酶活力達到最大值。

2.4 毒理試驗

圖1 菌株蛋白酶酶活及氨基態氮含量

圖2 CX1菌落圖與菌株形態圖

根據黃曲霉毒素在紫外光下顯色，將分離得到的黃曲霉菌株接種在YES培養基上，30℃培養7 d后，于紫外燈下觀測，CX1菌株（圖5左）與文獻中產黃曲霉毒素菌株（圖5右）進行對比[9]，圖5左結果顯示，CX1菌株不產熒光斑點，此黃曲霉不產毒素。

2.5 菌株應用

對黃酒發酵結果進行檢測，圖6-I說明當麩皮含量為20%、30%、40%時糖化力最高，能夠達到96.95 g/L。圖6-II說明麩皮添加量為0%、20%時氨基態氮含量較高，能達到1.51 g/L，當麩皮含量為50%時，氨基態氮含量最低為0.96 g/L，酒中主要的揮發性物質為異丁醇、己偶姻、乙酸糠酯、5-甲基糠醛和4-甲基愈創木酚。氨基態氮含量較高，可以解決大部分廠家黃酒中氨基態氮含量不能達標的技術難題。

圖3 黃曲霉菌株CX 1與近源菌株的系統發育樹

圖4 蛋白酶活曲線

圖5 紫外燈下黃曲霉顯色圖

3 結論與討論

從酒曲中篩選得到6株產蛋白酶的菌株，編號為CX1、CX2、CX3、CX4、CX5、CX6。通過斐林酚法復篩，得到高蛋白酶活力菌株CX1。對CX1進行鑒定，確定其為黃曲霉。利用黃曲霉毒素在紫外燈下有熒光反應進行毒理試驗，發現無熒光斑點，檢測無毒。CX1的蛋白酶活力最高可達到196 U/mL，進行發酵實驗測得氨基態氮1.51 g/L、糖度96.95 g/L。氨基態氮大于優質甜型黃酒的標準值。