miR-130a對缺氧誘導的人肺動脈平滑肌細胞增殖的影響

徐啟騰，宋 敏

1)青島市婦女兒童醫院心臟中心 山東青島 266022 2)青島大學附屬醫院保健科 山東青島 266022

肺動脈高壓是先天性心臟病最常見的并發癥，其致殘率和病死率均較高。肺動脈高壓的病理學特征為平滑肌細胞快速增殖致使小動脈內徑變細，導致肺動脈壓力升高。目前先天性心臟病肺動脈高壓仍缺乏有效的治療方式[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)參與肺動脈高壓的發生和發展[2]。近期的研究[2-3]提示miR-130a可能參與先天性心臟病肺動脈高壓的發病過程。研究[4]表明Wnt信號通路在先天性心臟病肺動脈高壓中參與肺動脈高壓血管重構過程。誘發肺動脈高壓發病的因素多而復雜，其中缺氧是重要原因[5]。因此本研究首先在先天性心臟病肺動脈高壓患者血清中檢測miR-130a的表達水平，并探討miR-130a對缺氧誘導的人肺動脈平滑肌細胞(human pulmonary artery smooth muscle cell，HPASMC)增殖及Wnt信號通路的影響,以期為開發新型小分子藥物用于靶向治療先天性心臟病肺動脈高壓提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1主要材料血清標本來源于2017年4月至2018年4月青島市婦女兒童醫院收治的先天性心臟病伴肺動脈高壓(CHD-PAH)患兒及肺動脈壓正常的先天性心臟病(CHD-norPAP)患兒各30例，患兒家屬知情同意。肺動脈高壓的診斷標準為靜息狀態下右心導管檢測的肺動脈平均壓>3.33 kPa，肺毛細血管壓或左房壓<2 kPa，運動狀態下肺動脈平均壓>4 kPa。血液樣本在室溫下靜置1 h，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，取上清于-80 ℃冰箱保存。HPASMC購于美國Science Cell公司；DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Gibco公司；miR-130a 抑制劑及抑制劑對照購于上海吉瑪制藥技術有限公司；RNA提取試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司；M-MLV反轉錄試劑盒、RIPA蛋白裂解液購于碧云天生物技術研究所；SYBR Premix Ex Taq試劑盒購于日本TaKaRa公司；Lipofectamine2000轉染試劑購于美國Invitrogen公司；EdU檢測試劑盒購于廣州市銳博生物科技有限公司；實驗所用引物均由上海生工生物工程有限公司設計合成；BCA蛋白定量檢測試劑盒購于武漢塞維爾生物科技有限公司；ECL發光檢測試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；Wnt1、β-catenin、GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購于英國Abcam公司。

1.2細胞培養及缺氧誘導將HPASMC加入到含體積分數0.5%胎牛血清的DMEM培養基中，置于含體積分數5%CO2、21%O2、74%N2的常氧培養箱中培養，24 h后將培養基更換為含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基，置于含體積分數5%CO2、3%O2、92%N2的缺氧培養箱中培養，24 h后收集細胞，記為缺氧組。常氧組細胞則置于常氧培養箱中培養24 h。

1.3細胞轉染取處于對數生長期的HPASMC，以含體積分數0.5%胎牛血清的DMEM培養基將細胞密度調整為5×104個/mL，取200 μL細胞懸液接種于96孔板中，置于常氧培養箱中培養24 h后采用Lipofectamine2000進行轉染，具體步驟依照說明書。將轉染后的細胞置于含體積分數5%CO2、3%O2、92%N2的缺氧培養箱中繼續培養48 h后進行指標檢測。將轉染miR-130a 抑制劑的細胞記為miR-130a 抑制物組，將轉染抑制劑對照的細胞記為陰性對照組，將未轉染的細胞記為空白對照組。

1.4qRT-PCR法檢測miR-130a表達水平提取血清樣本中、常氧及缺氧組HPASMC中、1.3中3組HPASMC中的總RNA，檢測RNA濃度和純度，將RNA反轉錄合成cDNA。miR-130a反轉錄引物序列5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACATGCCCT-3’，操作步驟按照M-MLV反轉錄試劑盒說明書進行。將得到的cDNA采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行PCR擴增。miR-130a引物：上游5’-GGCAGTCAATGCAATGTTAAAAG-3’，下游5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。以U6為內參，采用2-ΔΔCt方法計算miR-130a相對表達量。細胞實驗每組設置3個復孔，重復3次。

1.5細胞增殖情況的檢測取1.3中3組HPASMC，更換培養基為1 mL EdU培養基，繼續孵育2 h，棄含EdU的培養基，加入胰蛋白酶消化3 min，離心收集細胞，再加入200 μL Apollo?染色反應液室溫避光染色10 min，棄去染色液，再用Hoechst33342反應液進行DNA染色，PBS洗滌2次，上流式細胞儀測熒光強度。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.6Western blot檢測細胞中Wnt1和β-catenin蛋白表達水平提取1.3中3組HPASMC的總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，將蛋白與上樣緩沖液混勻后加熱變性，經100 g/L的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉法轉移至硝酸纖維素膜上，于含脫脂奶粉的封閉液中孵育4 h，分別加Wnt1和β-catenin抗體(均為1∶1 000稀釋)、二抗(1∶3 000稀釋)雜交。TBS洗滌后，采用ECL顯色發光，于暗室中以凝膠成像儀拍照，采用Image J圖像分析系統分析各條帶灰度值，以GAPDH為內參，以目的蛋白條帶與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析。CHD-norPAP組和CHD-PAH組、常氧組和缺氧組HPASMC中miR-130a相對表達量的比較均采用兩獨立樣本的t檢驗；3組間miR-130a相對表達量、相對熒光強度、Wnt1和β-catenin蛋白相對表達量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1CHD-norPAP組和CHD-PAH組、常氧組和缺氧組HPASMC中miR-130a表達的比較CHD-norPAP組和CHD-PAH組miR-130a的相對表達量分別為(1.00±0.09)、(2.01±0.08)(t=21.867,P<0.001)。常氧組和缺氧組HPASMC中miR-130a的相對表達量分別為(1.00±0.10)、(3.38±0.30)(t=13.741,P<0.001)。

2.2 3組HPASMC中miR-130a表達的比較結果見表1。由表1可知，與空白對照組和陰性對照組比較，miR-130a 抑制物組細胞中miR-130a的表達水平降低。

2.3 3組HPASMC增殖情況的比較結果見表1。由表1可知，與空白對照組和陰性對照組比較，miR-130a 抑制物組細胞相對熒光強度降低。

2.4 3組HPASMC中Wnt1、β-catenin蛋白表達的比較結果見圖1和表1。可知，與空白對照組和陰性對照組比較，miR-130a抑制物組HPASMC中Wnt1和β-catenin蛋白表達水平升高。

表1 3組HPASMC中miR-130a表達水平、相對熒光強度、Wnt1和β-catenin蛋白表達水平的比較

*：與其他2組比較，P<0.05

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：miR-130a抑制物組

3 討論

誘發肺動脈高壓發病的因素多而復雜，其中缺氧是重要原因[5]。目前主要通過觀察缺氧對HPASMC增殖、遷移、凋亡、分泌等生物學過程的影響研究其發病機制[6]。近期研究[2-3]表明miR-130a在CHD-PAH患者血漿中表達量升高，且參與肺動脈高壓血管重構，提示miR-130a與先天性心臟病肺動脈高壓有關。miR-130能夠增強缺氧誘導的小鼠平滑肌細胞的增殖，參與肺動脈高壓的右心室肥厚和血管重塑的發展[7]。本研究結果顯示，在CHD-PAH患兒血清中miR-130a的表達水平顯著高于CHD-norPAP患兒，且缺氧誘導的HPASMC中miR-130a的表達水平顯著高于常氧條件下培養的細胞，與上述研究結果一致。本研究結果還顯示，下調miR-130a的表達能夠抑制HPASMC增殖，提示miR-130a可能通過調控HPASMC的增殖參與先天性心臟病肺動脈高壓的發病過程。

目前研究[8]顯示，Wnt信號通路的異常將會導致多種癌癥、心血管疾病等的發生。β-catenin作為Wnt信號通路中核心效應分子，其表達水平的上調可啟動和激活下游靶基因的表達，誘導多種生物學過程的發生。有報道[9]指出，Wnt/β-catenin信號通路參與HPASMC的表型轉化、異常增殖和遷移等過程。Wnt信號傳導途徑的缺失是遺傳性和特發性肺動脈高壓中的常見分子缺陷[10-11]。miR-130a通過調控Wnt/β-catenin、NF-κB/PTEN等多種信號通路抑制多種腫瘤細胞的增殖[12]。上調的miR-130a通過調節順鉑處理的肝癌細胞中RUNX3和Wnt信號傳導通路增加順鉑耐藥性[13]。本實驗結果顯示，抑制miR-130a的表達能夠促進Wnt1和β-catenin蛋白的表達，提示下調miR-130a的表達能夠通過上調HPASMC中Wnt1和β-catenin蛋白的表達水平誘導Wnt信號通路的激活。以上結果說明miR-130a能夠通過調控Wnt信號通路抑制缺氧誘導的HPASMC的增殖。

綜上，在缺氧誘導的HPASMC中抑制miR-130a的表達可以抑制HPASMC的增殖，其作用機制與調控Wnt信號通路的激活有關。