心脈隆注射液對ADP和花生四烯酸誘導血小板聚集的影響

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1.大理大學藥學與化學學院，云南 大理 671000;2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000

異常血栓形成是很多心腦血管疾病的起因，如腦中風、心肌缺血和動脈粥樣硬化[1]。在血栓形成的過程中，血管受損會激活血小板、引起其粘附和聚集并與纖維蛋白相互作用[2]。因此，血小板聚集是血栓形成的重要事件，其功能失調會促進血栓性疾病的發展，而抗血小板聚集的藥物是治療心腦血管疾病的重要手段。

心脈隆注射液(Xinmailong injection，XML)是用美洲大蠊提取的生物活性物質制成，主要活性成分是一些小分子肽和氨基酸，為國家二類新藥，用于治療慢性心力衰竭，適應癥為心功能的C期、D期，臨床上無明顯不良反應，可安全使用[3]。近年來發現XML在心腦血管疾病中有廣泛的藥理活性，如對缺血性腦中風急性期有一定的治療作用，減少腦梗死面積[4]；對急性腦梗死合并慢性心力衰竭有輔助作用[5]；減輕氧化應激損傷血管平滑肌[6]；抑制缺血缺氧后心肌細胞的凋亡[7]；對抗動脈粥樣硬化，降低血清膽固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白[8]，還能保護受到動脈粥樣硬化損傷的血管內皮細胞[9]。在這些疾病中均有血小板聚集的異常，而目前未見XML對血小板聚集作用的報道。因此，本實驗采用體外實驗考察XML對二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP)和花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)誘導血小板聚集的作用，并探討XML對正常血小板是否有影響，以此了解XML對心腦血管疾病的作用是否與血小板功能有關。

1 材料

1.1 實驗動物 SD大鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，SPF級，雄性，體質量280～320 g，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.2 藥物與試劑 心脈隆注射液(批號：1703124，云南騰藥制藥股份有限公司)；一次性采血管(含129 mmol·L-1枸櫞酸鈉，批號：180906，瀏陽市三力醫用科技發展有限公司)；二磷酸腺苷(ADP，批號：716E022)和花生四烯酸(AA，批號：513B023)均購自北京索萊寶科技有限公司；替卡格雷(批號：C10061222，上海麥克林生物技術公司)；阿司匹林(批號：H172201，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.3 儀器 Agg RAMTM型血小板聚集儀(美國Helena公司)

2 方法

2.1 XML對ADP誘導血小板聚集的作用 取SD大鼠，10%水合氯醛(3mL/kg)麻醉后，分離腹主動脈用含129 mmol/L枸櫞酸鈉的采血管取血，800 rpm，離心10 min后吸取上層的富含血小板血漿(PRP)，下層血漿再經3500 rpm，離心10 min后吸取上層的貧含血小板血漿(PPP)。用PPP調整PRP至血小板數目為200×109個/L。將PRP隨機分為4組：溶劑對照(生理鹽水)組，陽性藥替卡格雷(0.05 g/L)組，XML 1、0.5 g/L組。將各組藥物加入PRP中(37 ℃)混勻孵育5 min，再加入ADP(10 μmoL/L)誘導血小板聚集，于血小板聚集儀中記錄血小板聚集曲線及血小板的最大聚集率，計算藥物對血小板聚集的抑制率 = (溶劑對照組血小板最大聚集率-藥物組最大血小板聚集率)/溶劑對照組血小板最大聚集率×100%。

2.2 XML對AA誘導血小板聚集的作用 同上制備PRP和PPP，調整PRP至血小板數目為500×109個/L，同上對PRP分組，陽性藥為0.1 g/L的阿司匹林，誘導劑為AA(0.5 mmoL/L)。藥物孵育PRP后加入AA誘導血小板聚集，記錄血小板的最大聚集率，計算藥物對血小板聚集的抑制率。

2.3 XML對正常血小板的作用 制備PRP和PPP，調整PRP至血小板數目為200×109個/L，將PRP隨機分為4組：溶劑對照(生理鹽水)組，XML高、中、低濃度組(1、0.5、0.25 g/L)組。用藥物孵育PRP后，直接記錄血小板聚集曲線和血小板最大聚集率，觀察XML對正常血小板的作用。

3 結果

3.1 XML抑制ADP誘導的血小板聚集 與溶劑對照組相比，1 g/L的XML能顯著性抑制ADP誘導的血小板聚集，差異有統計學意義(P<0.01)，抑制率為7.8%；而0.5g/L的XML作用不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)。陽性藥替卡格雷抑制ADP致血小板聚集作用非常明顯(P<0.01)，抑制率高達77.4%。結果見圖1和表1。

圖1 XML對ADP誘導血小板聚集的作用

組別濃度/g·L-1血小板最大聚集率/%抑制率/%溶劑對照71.5 ± 2.0替卡格雷0.05 16.1 ± 3.8??77.4 ± 5.0 XML1 65.3 ± 1.4??7.8 ± 1.60.569.9 ± 2.62.6 ± 3.0

注：與溶劑對照組比較，**P< 0.01。

3.2 XML抑制AA誘導的血小板聚集 XML抑制AA誘導血小板聚集的作用要優于抑制ADP對血小板聚集的誘導作用。與溶劑對照組相比，1 g/L和0.5 g/L的XML均能顯著性抑制AA誘導的血小板聚集，差異有統計學意義(P<0.01，P<0.01)，抑制率分別達到為57.7%和20.5%。與1 g/L的XML相比，陽性藥阿司匹林也能明顯抑制AA誘導的血小板聚集(P<0.01)，抑制率為57.4%。結果見圖2和表2。

圖2 XML對AA誘導血小板聚集的作用

組別濃度/g·L-1血小板最大聚集率/%抑制率/%溶劑對照42.3±2.3阿司匹林0.117.7±2.7??57.4±5.7XML1 17.4±5.6??57.7±14.40.532.8±6.3??20.5±17.6

注：與溶劑對照組比較，**P<0.01。

圖3 XML對正常血小板的作用

3.3 XML誘導血小板聚集 由圖3、表3可知，直接加入XML不能誘導血小板聚集。與溶劑對照組相比，加入1 g/L、0.5 g/L和0.25 g/L的XML后，血小板的最大聚集率均無明顯改變，差異無統計學意義(P>0.05)。

組別濃度/g/L血小板最大聚集率/%溶劑對照8.1±4.1XML306.8±3.5157.6±2.67.57.2±5.4

4 討論

血管損傷后，很多活性物質從內皮細胞釋放，趨化血小板粘附于受損部位，并與相應的表面受體結合活化血小板。活化的血小板釋放儲存的物質，如ADP、血清素、血小板活化因子、AA誘導的血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)等，啟動并促進血小板聚集。誘導血小板聚集的共同通路為引起細胞內Ca2+濃度增加來激活血小板膜上的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa[10-13]。本實驗中，心脈隆注射液(XML)對ADP和AA誘導的血小板聚集均有濃度依賴性的抑制作用，而對AA介導途徑的作用明顯強于ADP介導途徑，這可能與XML調節AA途徑中的幾個重要因子有關。有研究表明，XML能對抗動脈粥樣硬化對血管內皮細胞的損傷，升高動脈粥樣硬化大鼠的一氧化氮(Nitric oxide，NO)和前列環素(Prostaglandin I2，PGI2)水平，并降低內皮素(Endothelin，ET)水平，能減少血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)水平但無統計學差異[9]。由于NO和PGI2可抑制血小板聚集，而ET和TXA2(TXA2半衰期很短，其含量用下游產物TXB2表示)促進血小板聚集，XML對這些因子的作用均有利于其抑制AA誘導的血小板聚集。另外，在ADP誘導血小板聚集途徑中，ADP激活血小板表面ADP受體后，使細胞內cAMP降低并促進細胞內Ca2+增加，啟動血小板聚集[10]。目前未見XML對ADP和cAMP作用的報道，而有研究表明XML能增加心衰心肌細胞的Ca2+內流[14]。盡管XML對血小板的細胞內Ca2+作用可能不同于對心肌細胞的作用，這種XML對Ca2+作用也可能與XML對ADP誘導血小板聚集作用較弱有關。實驗也考察了XML對正常血小板的作用，發現所有濃度的XML均不會誘導血小板聚集。

目前，XML在臨床的主要適應癥為心功能C期與D期、紐約心臟病分級Ⅱ-Ⅳ級的心衰患者，可單獨使用，也可以合用洋地黃、血管緊張素轉化酶抑制劑、利尿劑、β-受體阻滯劑等。另外，XML對心腦血管缺血性疾病顯示出一定的療效，如急性心肌梗死[15]和急性腦梗死合并心力衰竭[5]。對這些缺血性疾病的治療過程中，在使用常規的抗血小板藥、抗凝藥和調脂藥的基礎上使用XML后發現能縮小梗死范圍[15]，減輕神經功能缺損[5]，除了XML具有對抗動脈粥樣硬化[9]、抑制過度自由基氧化[16]、抗心律失常[17]、促進神經干細胞增殖[18]，并分化為神經元的作用外，本實驗結果也表明XML對異常活化的血小板功能也有作用，其本身能直接抑制血小板聚集，改善血液流變學。實驗提示在合用抗血小板藥物時，XML更適合合用抑制ADP途徑的藥物(如氯吡格雷)優于合用抑制AA途徑的藥物(如阿司匹林)，這是因為藥物聯合使用通常考慮合用不同機制的藥物，而XML主要抑制AA誘導的血小板聚集，未見血栓傾向的心腦血管疾病使用XML也不會影響正常的血小板功能。綜上所述，實驗為XML治療缺血性心腦血管疾病提供了可能的一種機制。