3 種大米淀粉脫支前后結構及流變特性

曹 川，申明玉，許 莉，韋冬梅，周裔彬,*

（1.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230001；2.安徽糧食工程職業學院糧食工程系，安徽 合肥 230011）

淀粉作為能量儲存物質，廣泛來源于種子、水果及植物根系中，不同植物來源淀粉的形態和結晶結構各不相同，直鏈淀粉、支鏈淀粉組成有所差異，理化性質以及對普魯蘭酶水解的靈敏性也不同[1-2]。普魯蘭酶是一種脫支酶，作為外切酶，能夠專一性地切割葡萄糖α-1,6-糖苷鍵，應用于淀粉的脫支[3]。不同脫支程度淀粉產物的聚合度（degree of polymerization，DP）不同，淀粉完全脫支產生具有一定鏈長的線性糊精，DP范圍一般在6～100之間，Klaochanpong[4]和Precha-Atsawanan[5]等比較脫支蠟質淀粉與天然蠟質淀粉的膠凝性能發現，脫支淀粉（debranched starches，DBS）產生的凝膠較為混濁，具有光澤的外觀和較低的黏度，而天然淀粉產生的凝膠均勻、透明且黏度較高。Liu Guodong等[6]應用普魯蘭酶對4 種不同來源DBS的水解特性和凝膠特性進行研究，結果表明：所有DBS均為V型淀粉，具有中空、單螺旋結構；脫支處理對淀粉黏度影響較大，使淀粉黏度下降，DBS能夠捕獲水以形成水凝膠；脫支有效地改善了淀粉的溶解度和持水能力，有助于其凝膠的形成。DBS的特殊功能特性逐漸受到研究者的青睞，特別在回生特性、凝膠性能等方面[7-8]。

本實驗選擇糯米、粳米和秈米3 種大米淀粉，研究普魯蘭酶處理前后3 種大米淀粉脫支衍生物的晶體結構、分子質量分布、溶解度、黏度和流變學特性，為淀粉基包埋產物的緩慢釋放提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米、粳米和秈米由安徽省惠豐糧食儲備庫提供。

普魯蘭酶（EC 3.2.1.41） 美國Sigma公司；氫氧化鈉、乙酸鈉、無水乙醇、乙酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RVA-4500快速黏度分析儀 瑞典波通儀器公司；TTR-III X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀日本理學電機公司；Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）儀、ICS5000高效陰離子交換色譜（high-performance anionexchange chromatography，HPAEC）儀、Dionex?CarboPac? PA200離子交換柱（250 mm×1 mm，5.5 μm） 美國Thermo Fisher Scientific公司；DHR系列流變儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 DBS的制備

通過稀堿浸泡分離法制得糯米、粳米和秈米3 種大米淀粉，3 種大米原淀粉中直鏈淀粉質量分數分別為糯米1.97%、秈米25.65%、粳米17.23%。

DBS制備：參考劉國棟[9]和Cai Liming[10]等的方法，并做適當修改。將淀粉和乙酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 5.5）按料液比1∶20加入500 mL帶塞錐形瓶中，置于集熱式磁力攪拌器上于105 ℃下恒溫攪拌30 min，然后轉移到滅菌鍋中，121 ℃下加熱1 h徹底糊化，再將淀粉糊冷卻至50 ℃，加普魯蘭酶，50 ℃反應12 h，將酶解液濃縮至200 mL后緩慢加入無水乙醇中，容量瓶定容至1 000 mL，放置室溫過夜，再以5 000 r/min離心15 min，收集沉淀物，沉淀用無水乙醇洗滌3 次，最后冷凍干燥、研磨和篩分，待用。

1.3.2 XRD分析

采用XRD儀測定天然淀粉和DBS冷凍干燥粉末的結晶度。儀器條件：管壓40 kV、管流80 mA、衍射角（2θ）掃描區域為0°～50°、掃描速率2°/min。參考Lopez-Rubio等[11]的方法使用PeakFit 4.12軟件對淀粉顆粒結晶峰面積和非晶區域進行分析。平均鏈長（以DP表示）按式（1）計算。

1.3.3 HPAEC分析

參考Liu Guodong等[1]的方法，采用HPAEC儀（配備電化學檢測器）測定天然淀粉和DBS冷凍干燥粉末的鏈長分布。分析條件：進樣量50 μL；柱溫25 ℃；流動相A為ddH2O；流動相B為100 mmol/L NaOH；流動相C為100 mmol/L NaOH/500 mmol/L NaAc；流速0.5 mL/min。

1.3.4 FT-IR分析

稱取一定質量的天然淀粉和DBS冷凍干燥粉末，分別添加100 倍質量的無水KBr研磨混合，將所得樣品粉末壓縮成薄圓盤狀。掃描范圍為4 000～400 cm－1，分辨率為4 cm－1。

1.3.5 黏度分析

采用快速黏度測定儀對天然淀粉和DBS的黏度進行測定。測試程序參考美國谷物化學家協會的方法[12]進行，水分質量分數設定為14%，稱取樣品冷凍干燥粉末3.00 g，加入蒸餾水25 mL。溫度設定程序：50 ℃保持1 min，以12 ℃/min上升到95 ℃，保持2.5 min，再以12 ℃/min下降到50 ℃，保持1.4 min。待天然淀粉完成黏度測定后取出糊化桶，將普魯蘭酶加入混合物中，重新設定程序使溫度在50 ℃保持60 min，測定DBS黏度。

1.3.6 流變學性質分析

淀粉糊糊化完全后冷卻至50 ℃，添加普魯蘭酶，繼續在集熱氏磁力攪拌器中105 ℃恒溫攪拌1 h，采用流變儀對天然淀粉和DBS流變學性質進行測定。選擇40 mm平板，間隙值設定為1 050，擦去多余樣品，重新設間隙值為1 000。動態流變設定程序為：振蕩頻率0.1～10，應變2%，9 個點。靜態流變設定程序為：流動掃描，剪切速率0.1～100 s－1，6 個點。

1.3.7 水解特性分析

1.3.7.1 持水力測定根據Liu Guodong等[1]的方法對淀粉持水力進行測定。

1.3.7.2 膨脹能力測定

用蒸餾水配制質量濃度為5 g/100 mL的淀粉乳，置于集熱式磁力攪拌器上，于105 ℃下恒溫攪拌，待完全糊化后，取10 mL乳液于離心試管中，3 000 r/min離心30 min，收集上清液，所得沉淀即為膨脹淀粉。將上清液置于表面皿中于105 ℃烘至恒質量，得到水溶淀粉，稱質量并記錄[13]。按式（2）、（3）計算淀粉的溶解度和膨脹能力。

式中：S為溶解度/%；m1為上清液蒸干至恒質量后的質量/g；m0為稱取淀粉質量/g；m2為沉淀質量/g。

1.4 數據處理與分析

實驗數據采用Origin 8.0和SPSS 19.0軟件對數據進行相關性分析和逐步回歸分析。

2 結果與分析

2.1 XRD分析結果

圖 1 3 種大米淀粉（A）及其DBS（B）的XRD圖譜Fig. 1 XRD patterns of native rice starch (A) and DBS (B)

由圖1可知，3 種大米天然淀粉（IS、JS、WS）XRD峰的位置主要集中在10°～27°，在衍射角2θ為15°、17°、18°和23°時出現較強的特征衍射峰，這屬于典型的A型淀粉[14]，而DBS衍射峰的位置出現變化，DBIS、DBJS和DBWS衍射峰的位置主要集中在7.9°、13.5°、15°、17°、18°、21°和23°，表明DBS的結晶度明顯低于天然淀粉，無定形區增加，表明經過普魯蘭酶水解后形成的晶體結構向無定形和無序的淀粉鏈發展，進入無序凝膠網絡[15-16]。DBWS在7.9°、13.5°、15°、17°、18°、21°特征衍射峰強度高于DBIS和DBJS，表明DBWS中直鏈含量明顯增多。

2.2 鏈長分布分析結果

圖 2 3 種大米淀粉的鏈長分布Fig. 2 Distribution of chain lengths of native and debranched rice starch

根據分支鏈長淀粉可分為4 種類型：A鏈：DP為6～12；B1鏈：DP為13～24；B2鏈：DP為25～36；B3鏈：DP大于37[17]。HPAEC-脈沖電流檢測器可以確定DP范圍為6～60[18-19]。采用支鏈淀粉酶選擇性水解α-1,6-糖苷鍵，將支鏈切下，得到線性短鏈淀粉。本實驗選擇3 種大米淀粉經過支鏈淀粉酶徹底脫支，研究支鏈淀粉酶對水解淀粉分支結構和性質的影響。由圖2可知，3 種DBS的精細結構相似。DBIS含有較多長鏈淀粉分支（B2和B3鏈：27.47%），而DBWS與其他兩種大米淀粉相比，A鏈的相對含量為32.61%，所占比例較高，B2和B3鏈為22.08%，所占比例最低。DBWS的平均鏈長最短（DP為19.27），DBIS的平均鏈長最長（DP為21.34）；普魯蘭酶可以選擇性地水解α-1,6-D-糖苷鍵。以上結果表明，普魯蘭酶水解反應對較短的支鏈更有效，鏈長越短越容易被切割，反之亦然[20]。

2.3 FT-IR分析結果

圖 3 3 種大米淀粉及其DBS的FT-IR圖譜Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of raw and debranched rice starch

由圖3可知，在天然淀粉中，通常情況下在3 385 cm－1處的寬帶歸因于—OH伸縮振動，在1 250 cm－1處的波段對應于—OH彎曲振動[21]。3 種大米淀粉及其DBS的FT-IR光譜之間峰形沒有明顯差別，但DBS的峰強度有所增強。天然淀粉在脫支過程中α-1,6-糖苷鍵不斷被水解斷裂，—OH數量隨之增加，導致在3 000～4 000 cm－1處的吸收峰變得狹長，3 410 cm－1處的—OH伸縮振動吸收峰相對增強。

2.4 黏度分析結果

圖 4 3 種大米淀粉脫支前后的黏度變化趨勢Fig. 4 Trend of viscosity in raw and debranched rice starch

由圖4和表2可知，不同來源淀粉脫支前后的黏度不同。在糊化過程中，3 種大米的天然淀粉顯示出典型的布拉本德黏度曲線。WS的糊化曲線與IS和JS有較大差異；WS短時間內達峰值黏度，之后迅速下降，在冷卻過程中譜線平緩，而IS和JS達到峰值黏度的時間略長，冷卻過程中黏度回升明顯，最終黏度高于WS。IS峰值黏度、最終黏度較高說明IS顆粒分子間締合、交聯程度較大，排列緊密，抗剪切力較強。崩解值反映了淀粉顆粒結構在加熱過程中的穩定性，崩解值越大淀粉顆粒越不穩定。本實驗中JS崩解值最大，說明其淀粉顆粒熱穩定性差，而WS呈現較低的峰值黏度，表明其有較高的抵抗膨脹和破裂能力[22]。WS的回生值僅為726 mPa·s，表明WS與其他兩種淀粉相比不易退化和發生分子聚集[15]。當將普魯蘭酶添加到系統中時，淀粉糊黏度急劇下降。由表2可知，DBWS、DBJS和DBIS的最終黏度較其天然淀粉分別降低了94.99%、56.15%和52.84%。DBWS黏度較DBJS和DBIS下降快，表明WS對普魯蘭酶更為敏感，容易被水解。支鏈淀粉以及支鏈淀粉鏈長所占的比例，可能對淀粉糊的最終黏度具有重要影響。IS的糊化溫度最高，說明其在自然水分下加熱時晶體崩解所需熱量最低，凝膠稠度最小。WS的糊化溫度最低，說明其在自然水分下加熱時晶體崩解所需熱量最高，凝膠稠度最大，究其原因可能是直鏈淀粉含量的差異性[23-24]。為保持酶活力，淀粉糊化后加入普魯蘭酶，測定DBS黏度，溫度設定為50 ℃，溫度過高會導致酶活力喪失，因此DBS糊化溫度未測定。

表 2 3 種大米淀粉脫支前后的黏度變化Table 2 Viscosity change before and after debranching of rice starch

2.5 流變學特性分析結果

2.5.1 動態流變學特性分析結果

圖 5 3 種大米淀粉脫支前后的動態流變變化趨勢Fig. 5 Trend of dynamic rheology in raw and debranched rice starch

由圖5可知，3 種大米淀粉儲能模量（G’）和損耗模量（G’’）均隨著頻率的增加而上升，表現為典型的弱凝膠動態流變學特征，IS的黏性和彈性均為最高，WS均為最低，這可能是由直鏈淀粉含量差異導致的。脫支后DBS的G’和G’’整體隨頻率增加而上升，但G’最終值差異較小，而DBIS的G’’最高，DBWS最低，這與黏度分析結果相同，3 種DBS的G’和G’’都較其天然淀粉降低，說明脫支處理使凝膠強度降低，凝膠表現出液體特性。經過脫支處理，淀粉分子內部結構重組，分子鏈被切割，直鏈淀粉含量增多，分子鏈段纏繞變少，黏度降低，凝膠強度降低[25]。

2.5.2 靜態流變學特性分析結果

圖 6 3 種大米淀粉脫支前后的靜態流變變化趨勢Fig. 6 Trend of static rheology in raw and debranched rice starch

由圖6可知，3 種大米天然淀粉及其DBS的剪切應力均隨剪切速率的增加而增大，具有假塑性流體特征；曲線均不同程度地屈向剪切應力軸，可以判斷出其均屬于非牛頓流體；3 種大米天然淀粉的表觀黏度均在剪切速率為0～10 s－1時急劇下降，表現出更強的剪切稀化現象，經過普魯蘭酶處理后的3 種DBS的剪切應力和表觀黏度均比天然淀粉低，這可能是由于脫支處理后分子鏈斷裂，使分子鏈更利于流動[26-27]。2.6 水解特性分析結果

表 3 3 種大米淀粉及其DBS的水解特性Table 3 Hydrolysis characteristics of raw and debranched rice starch

由表3可知，3 種大米天然淀粉的溶解度較低，膨脹能力較高，經普魯蘭酶脫支后溶解度增加，膨脹能力減小，究其原因可能是脫支使得直鏈淀粉含量增加，直鏈淀粉的雙螺旋結構在淀粉糊化過程中很難破壞，因此能抑制淀粉分子的膨脹，增加其溶解度[28]。鏈長會影響持水力，鏈長越長越易凝結成塊，從而容納更多的水分。IS的持水力高于WS和JS，直鏈淀粉含量和支鏈長度是造成這種差異的主要原因。直鏈淀粉傾向于形成不溶性凝膠網絡，持水力差，而較長的鏈可以捕獲更多的水分形成水凝膠。相反，高度分枝支鏈淀粉不太容易重新結合[29]。因此，由于短鏈數量增加，DBS持水力提高。

3 結 論

本實驗研究結果表明，經普魯蘭酶水解后，DBS短鏈葡聚糖鏈比例增加。與秈米和粳米淀粉相比，糯米淀粉對普魯蘭酶更為敏感，鏈長分布結果表明糯米淀粉的A鏈相對含量為32.61%，平均鏈長最短（DP為19.27），傾向于形成更短的鏈，淀粉糊黏度急劇減少，普魯蘭酶水解后形成的晶體結構向無定形和無序的淀粉鏈發展，進入無序凝膠網絡。脫支前后3 種大米淀粉FT-IR曲線沒有明顯差異，脫支后淀粉黏度、G’和G’’都有所降低，淀粉顆粒分子間締合、交聯程度變弱，排列松散。天然淀粉的溶解度較低，膨脹能力較高，經過普魯蘭酶脫支后溶解度增加，膨脹能力減小，推測鏈長會影響持水力。基于以上結果，發現DBS親水性強，低相對分子質量線性短鏈淀粉相對含量增加，分子運動性增強，重新組合形成更加致密的凝膠結構。糯米淀粉對普魯蘭酶處理較其他兩種大米淀粉更為敏感。經過普魯蘭酶脫支后的大米淀粉增強了分子聚集和締結，在親水介質中，DBS能快速形成凝膠結構，抑制酶液降解，使淀粉的抗酶解能力增加，增強淀粉的流動性和壓實性能。DBS可以作為膠凝劑、混濁劑、脂肪替代品以及谷物類早餐食品的包衣等[9,30]，也可用于包埋運載藥物及活性物質等。