不同產地黨參多糖含量及抗氧化活性比較

葉英　李珊　張景宜　趙永珍　哈生云　劉圓

摘要 [目的]比較不同產地黨參多糖含量及抗氧化活性。[方法]采用單因素和正交試驗設計優化黨參多糖提取工藝條件，對不同產地黨參多糖的含量進行比較，并采用ABTS、DPPH自由基清除率試驗及鐵離子還原法對不同產地黨參多糖抗氧化活性進行比較。[結果]超聲輔助法提取黨參多糖的最佳工藝條件為超聲溫度60 ℃、超聲時間40 min、料液比1∶30、提取次數3次;此條件下，吉林長白山的黨參多糖得率最高，達29.56%，其次是青海尖扎黨參，多糖含量達22.38%。不同產地黨參多糖對ABTS自由基清除能力從大到小依次為甘肅定西、青海尖扎、青海大通、四川雅安、山西太行、吉林長白山，對DPPH自由基清除能力從大到小依次為甘肅定西、青海大通、青海尖扎、山西太行、吉林長白山、四川雅安，鐵離子還原能力從大到小依次為青海大通、甘肅定西、吉林長白山、山西太行、四川雅安、青海尖扎。[結論]該研究為黨參多糖的質量品質評價及抗氧化功能性食品的研究開發提供理論依據。

關鍵詞 黨參多糖;不同產地;含量;抗氧化活性

中圖分類號 R284文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）21-0184-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.055

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Comparison of Polysaccharide Content and Antioxidant Activity of Codonopsis pilosula in Different Producing Areas

YE Ying， LI Shan， ZHANG Jingyi et al

（College of Agriculture and Animal Husbandry，Qinghai University，Xining，Qinghai 810016）

Abstract [Objective] The research aimed to compare the polysaccharide content and antioxidant activity of Codonopsis pilosula in different producing areas.[Method]The extraction conditions of Codonopsis pilosula polysaccharides were optimized by single factor and orthogonal design. The content of Codonopsis pilosula polysaccharides from different producing areas was compared，and the antioxidant activities of Codonopsis pilosula polysaccharides were compared by ABTS free radical， DPPH free radical scavenging rate test and iron ion reduction method. [Result]The optimum conditions for ultrasonic extraction of Codonopsis pilosula polysaccharides were as follows： ultrasonic temperature 60 ℃， ultrasonic time 40 min， solidliquid ratio 1∶30， extraction times 3 times. Under the optimum extraction conditions， the yield of polysaccharide from Codonopsis pilosula was 29.56% in Changbai Mountain of Jilin Province，followed by Codonopsis pilosula in Jianzha of Qinghai Province， and the content of polysaccharide was 22.38%. The scavenging capacity of Codonopsis pilosula polysaccharides from different producing areas to ABTS free radicals from large to small was Gansu Dingxi，Qinghai Jianzha， Qinghai Datong， Sichuan Yaan， Shanxi Taihang， Jilin Changbai Mountain. The scavenging capacity of DPPH free radicals from large to small was Gansu Dingxi， Qinghai Datong， Qinghai Jianzha， Shanxi Taihang， Jilin Changbai Mountain， Sichuan Yaan， and iron reduction capacity from large to small was Qinghai Datong， Gansu Dingxi， Jilin Changbai Mountain， Shanxi Taihang，Sichuan Yaan， Qinghai Jianzha.[Conclusion] The research provides theoretical basis for the quality and quality evaluation of Codonopsis pilosula polysaccharides and the research and development of antioxidant functional foods.

Key words Codonopsis pilosula polysaccharide;Different producing areas;Content;Antioxidant activity

基金項目 青海省科技合作專項（2016-HZ-821）。

作者簡介 葉英（1983—），女，湖北咸寧人，副教授，博士，從事青藏高原特色生物資源及功能性食品研發研究。通信作者，教授，博士，碩士生導師，從事民族藥品種、品質評價和新藥資源開發與利用研究。

收稿日期 2019-06-02;修回日期 2019-06-18

黨參（Codonopsis pilosula）又名黃參、黃黨[1]，富含多種活性成分，藥效與人參相近，它經常在醫學上用來代替人參使用[2]。作為一種傳統的滋補藥，黨參有補益元氣、健脾、益肺的作用，主要用于血虛不足和萎黃、脾胃虛弱、長期腹瀉等的治療，具有祛痰止咳、生津止渴等效用[3]。黨參不僅作為藥材藥用，還可作為保健食品食用，是天然的優質資源。近年來，研究學者對黨參的化學成分及生物活性進行了廣泛研究[4-6]，同時也拓展了黨參功能性食品的開發應用前景。黨參主要成分包括萜類、糖、甾體類、黃酮類等，其中多糖作為黨參的主要有效成分之一，具有抗氧化[7]、抗腫瘤[8-9]、增強記憶力[10]、提升機體免疫力[11]等作用。張雅君等[12]研究發現黨參多糖是一種新型的免疫調節劑，對小鼠巨噬細胞的吞噬能力具有顯著的提高作用;秦楠等[13]以黨參多糖為原料，研制出黨參蕎麥保健醋飲料;廖威等[14]以黨參、蘆薈為研究原料，研制出具有消炎殺菌功能的復合保健飲品。

我國黨參資源豐富，各地均有大量栽培，黨參多糖及其抗氧化活性也成為研究熱點[15-17]，但是關于不同產地黨參多糖含量及抗氧化活性比較鮮見報道。我國不同地區氣候差異較大，可能導致黨參品質迥異，尤其是青藏高原地理環境特殊，獨特的冷涼氣候致使許多植物有效成分的積累與其他地區截然不同，生物活性可能也會存在較大差異。該研究采集了我國地理分布差異較大的6種黨參，通過單因素和正交試驗對黨參多糖提取進行工藝優化，并對青藏高原地區與國內其他幾個黨參主產區的黨參多糖含量進行差異性研究，通過測定ABTS、DPPH自由基清除率及鐵離子還原能力等，比較不同產地黨參多糖的抗氧化活性，以便為黨參多糖的質量品質評價、種植生境選擇及抗氧化功能性食品的研究開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黨參，產地青海尖扎、青海大通、四川雅安、吉林長白山、山西太行、甘肅定西。

苯酚，天津市富宇精細化工有限公司;羥自由基試劑盒、超氧陰離子自由基試劑盒，南京建成生物工程研究所;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（ABTS）、2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（DPPH），南京奧朵福尼生物科技有限公司;無水乙醇、冰乙酸、無水乙酸鈉，均為分析純。

1.2 儀器與設備

KC-130小型粉碎機，浙江武義鼎藏日用金屬制品廠;SB-3200DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-2600紫外可見分光光度計，島津企業管理有限公司;ESJ110-4B電子天平，沈陽龍騰電子有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南予華儀器有限公司;XW-80A旋渦混合器，上海馳唐電子有限公司;RE-2008B旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 黨參多糖不同提取方法對比研究[18]。

黨參粉碎后過60目篩，各稱取2份1.00 g粉末，按1∶30料液比，浸泡于蒸餾水中30 min，并在相同條件（30 min，60 ℃）下進行常規加熱提取和超聲提取，依據苯酚-硫酸法[19]測定原理測定其多糖含量。

1.3.2 多糖含量測定方法。

參考朱志川等[20]的方法。分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL的1 mg/mL葡萄糖標準溶液于具塞比色管中，加入6%苯酚溶液1 mL并定容至2 mL，搖勻后快速加入5.0 mL H2SO4，靜置5 min后再沸水浴15 min，冷卻后于490 nm處測定吸光度，以葡萄糖標準溶液的質量濃度（mg/mL）為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得回歸方程y=15.729x+0.017 1（R2=0.997 8），根據回歸方程及公式（1）計算樣品中多糖含量。

多糖提取率=（C×V×N）/M×100%（1）

式中，C為測定的不同吸光度所對應的多糖溶液濃度（mg/mL）;V為移取稀釋后粗多糖溶液的體積（mL）;N為稀釋倍數;M為干燥的黨參樣品粉末質量（g）。

1.3.3 單因素試驗。

采取超聲法進行單因素試驗，研究不同提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、提取時間（20、30、40、50、60 min）、料液比[1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）]及提取次數（1、2、3、4、5次）對黨參多糖得率的影響。

1.3.4 正交試驗。

以單因素試驗結果為基礎，多糖得率為考察指標，設計L9（34）正交試驗（表1），以確定黨參多糖提取的最佳工藝參數。

1.3.5 不同產地黨參多糖含量比較。

分別稱取6個不同產地（青海尖扎、青海大通、四川雅安、吉林長白山、山西太行和甘肅定西）黨參樣品各1.00 g，按“1.3.2”方法測定多糖含量，并進行比較。

1.3.6 ABTS自由基清除能力測定。

參考Zhang等[21]的方法。稱取0.33 g過硫酸鉀，加入7 mmol/L ABTS溶液，于避光、室溫條件下攪拌均勻，反應16 h后，在734 nm處，用PBS溶液將該混合液的吸光度稀釋至0.700±0.005。用蒸餾水配制黨參多糖溶液至不同濃度（1.5、3.0、6.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120.0 mg/mL），按體積比為1∶20（V∶V）與ABTS溶液混合均勻，并以VC為陽性對照，在避光、室溫下反應6 min后于734 nm處測定吸光度，并按公式（2）計算ABTS自由基清除率[22]。

清除率=1-A1A0×100%（2）

式中，A1為測得樣品吸光度;A0為測得空白對照吸光度。

1.3.7 DPPH自由基清除能力測定。

參考劉志慶等[23]的方法。各吸取2 mL不同濃度（0.005、0.010、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300 mg/mL）的黨參多糖溶液，并加入5×10-5 mol/L DPPH溶液2 mL，室溫條件下靜置反應30 min，于517 nm處測定吸光度，并按公式（2）計算清除率。

1.3.8 鐵離子還原能力測定。

參考韓洪坤等[24]的方法。按10∶1∶1（V∶V∶V）體積比配制FRAP工作液（pH = 3.6，300 mmol/L NaAc-HAc緩沖液、20 mmol/L FeCl3溶液和10 mmol/L TPTZ溶液）。各吸取150 μL不同濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）FeSO4溶液，分別加入4.5 mL上述工作液，37 ℃溫水浴下反應10 min，于593 nm處測定吸光度，得標準曲線方程y=0.810 1x+0.042 8（R2=0.996 8）。

配制濃度為10 mg/mL的不同黨參多糖溶液，按上述標準曲線操作方法進行試驗，并用50 μg/mL VC溶液進行陽性對照，于593 nm處測定其吸光度。代入標準曲線算出對應的FeSO4濃度，還原力用對應的FeSO4濃度（μmol/L）表示。計算公式為抗氧化能力（μmol/L FeSO4）=OD樣品-OD空白。

1.3.8.1 重現性試驗。

稱取同一份黨參多糖樣品，每2 h取一次，進行8次獨立試驗，計算該還原力結果所對應的相對標準偏差（RSD），以評價重現性優劣。

1.3.8.2 精密度試驗。

按照上述“1.3.8.1”的操作步驟，以多次測定、計算出的還原力結果的相對標準偏差（RSD）來評價該方法的精密度優劣。

1.3.8.3 可靠性試驗。

配制黨參多糖溶液0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL，按照上述FeSO4標準曲線操作方法分別進行試驗，用線性相關系數r評價該方法的可靠性，觀察濃度-還原力線性關系。

2 結果與分析

2.1 常規加熱法和超聲提取法制備黨參多糖比較

常規加熱法和超聲提取法對黨參多糖得率的影響結果見表2所示，發現超聲提取法效果優于常規加熱法，黨參多糖得率達19.52%±0.14%，是常規加熱提取法的 3 倍，說明超聲提取法是提取黨參多糖的較優方法。

安徽農業科學 2019年

2.2 超聲法提取黨參多糖的單因素試驗

2.2.1 提取時間對黨參多糖得率的影響。

由圖1可知，黨參多糖得率隨時間的增加明顯升高，提取時間達40 min時，黨參多糖得率最高，為18.66%±0.12%;時間超過40 min后，多糖得率下降，推測可能是由于超聲提取時間過長導致黨參多糖結構不穩定而分解，同時雜質溶出增加，進而導致多糖得率下降。因此，黨參多糖提取時間建議控制在40 min左右。

2.2.2 料液比對黨參多糖得率的影響。

由圖2可知，隨著料液比的增大，黨參多糖得率呈現出先升高后降低的趨勢，當料液比達1∶40時，黨參多糖得率達最大值，為32.14%±0.47%。當料液比大于1∶40，黨參多糖得率開始下降，這可能因為料液比過大導致黨參中雜質溶出增加造成的，因此，從黨參多糖得率和節約溶劑角度考慮，建議料液比選用 1∶40左右為宜。

2.2.3 提取溫度對黨參多糖得率的影響。

由圖3可知，黨參多糖得率隨溫度的升高而增大，當溫度達到50 ℃時，多糖得率達到最大，為38.42%±0.25%，之后隨著超聲溫度上升黨參多糖得率開始緩慢下降，這可能是黨參多糖結構在高溫超聲作用下被破壞的原因。因此黨參多糖提取過程中溫度應控制在50 ℃左右。

2.2.4 提取次數對黨參多糖得率的影響。

由圖4可知，黨參多糖得率隨提取次數的增加呈現出先增大后減小的趨勢，當提取次數達3次時，黨參多糖得率達最大值，為25.38%±0.32%。這可能是由于提取次數過多導致黨參中其他非糖類物質溶出增加。因此，黨參多糖提取次數建議3次為宜。

2.3 超聲法提取黨參多糖的正交試驗

以單因素試驗結果作為基礎，多糖得率為考察指標，對提取時間、提取溫度、料液比、提取次數4個因素進行考察，開展正交設計試驗。結果見表3。 由表3可知，以黨參多糖得率為指標，4個因素影響大小順序為A（提取時間）>D（提取次數）>C（料液比）>B（提取溫度），最優提取工藝組合為A2B3C1D2，即黨參多糖最優提取工藝方案為提取時間40 min、提取溫度60 ℃、料液比1∶30、提取次數3次。

2.4 不同產地黨參多糖含量比較

經分析，6個不同產地黨參多糖含量從大到小依次為吉林長白山、青海尖扎、四川雅安、青海大通、山西太行、甘肅定西。不同產地黨參多糖含量差異較大，其中產自吉林長白山的黨參多糖含量最高，為29.56%±0.15%，青海尖扎（22.38%±0.12%）次之，甘肅定西黨參多糖含量最低，為19.58%±0.02%。這可能是由于黨參的光照、土壤、降水量以及氣候等條件環境不同造成的，長白山的火山使其土壤含有豐富的礦物質，降水量足，雖然光照時間短但有明顯的垂直氣候變化，可能有利于糖分積累，而甘肅定西屬于黃土高原地域的丘陵溝壑區，土壤貧瘠，降水量少且多暴雨，獨特的半濕潤半干旱氣候，可能不利于糖類物質的合成。

2.5 不同產地黨參多糖體外抗氧化能力比較

2.5.1 ABTS自由基清除率分析。

由圖5可知，黨參多糖對ABTS自由基清除率開始隨樣品濃度增大而增加，達到一定濃度后，ABTS自由基清除率達到最大值，繼續增大黨參多糖樣品濃度，清除率開始逐步減小，清除率減小可能是黨參多糖的溶解性降低造成的。當清除率達最大值時，不同產地黨參多糖對ABTS自由基清除能力從大到小依次為甘肅定西、青海尖扎、青海大通、四川雅安、山西太行、吉林長白山。甘肅定西產的黨參多糖雖然含量最低，但是其抗氧化能力最強，對ABTS自由基清除率最高可達87.26%，這可能與黨參多糖種類不同有關;青海尖扎及青海大通產的黨參多糖對ABTS自由基清除能力次之，青海地處青藏高原，此生境中的植物大多具有抗逆性，化學成分積累有其獨特性，較強的抗氧化能力可能與其長期高寒缺氧的適應性有關。

2.5.2 DPPH自由基清除率分析。

由圖6可知，黨參多糖對DPPH自由基清除效果在濃度為0～0.30 mg/mL呈現先增大后略微下降趨勢，當濃度達到一定值后其對DPPH自由基的清除效率達到最大，而后隨著濃度的增加清除率有一定程度下降，最終清除率變化趨于穩定。在最優濃度條件下，各產地的黨參多糖對DPPH自由基清除能力從大到小依次為甘肅定西、青海大通、青海尖扎、山西太行、吉林長白山、四川雅安。對DPPH自由基清除率最高的是甘肅定西產的黨參多糖，最高值達73.70%，其次是青海大通與青海尖扎，清除能力最弱的是四川雅安產的黨參多糖，這可能與不同產地黨參多糖種類及其溶解性差異有關，其具體作用機制還需進一步深入研究。

2.5.3 鐵離子還原能力分析。

由圖7可見，不同產地黨參多糖水溶液（10 mg/mL）對鐵離子還原能力在230～413 μmol/L FeSO4，經比較其抗氧化能力效果從大到小依次為青海大通、甘肅定西、吉林長白山、山西太行、四川雅安、青海尖扎。青海大通產的黨參多糖對鐵離子還原能力最大，達 413 μmol/L FeSO4，青海尖扎產的黨參多糖對鐵離子還原能力最差，僅為230 μmol/L FeSO4，兩者均產于高寒缺氧的青藏高原，氣候條件有相似之處，但是差異如此之大，推測可能是兩地的土壤類型不同造成多糖種類迥異的原因，青海大通主要為黑鈣土，植物生長所需的營養物質較為豐富，青海尖扎土壤相對貧瘠些，部分土壤鹽堿化，易板結且透水透氣性不太好，2種差異較大的土壤環境使黨參多糖在積累過程中的差異較大，不同多糖種類及含量導致在鐵離子還原方法（FRAP法）中三價鐵離子被還原成二價鐵離子的過程中起到的作用不盡相同，具體多糖種類及結構的差異有待深入研究。

2.5.3.1 重現性試驗。

按照“1.3.8.1”操作，8個平行試驗測定黨參多糖溶液的還原力相對標準偏差RSD為3.93%，說明FRAP法用來測定不同產地黨參多糖的鐵離子還原力重現性較好。

2.5.3.2 精密度試驗。

按照“1.3.8.2”操作，8個平行樣品測定黨參多糖溶液的還原力相對標準偏差RSD為1.07%，說明FRAP法用來測定不同產地黨參多糖的鐵離子還原力精密度良好。

2.5.3.3 可靠性試驗。

以青海尖扎的黨參提取多糖為例，以黨參多糖樣品的濃度x（mg/mL）和梯度濃度樣品溶液的還原力y（μmol/L FeSO4）進行線性回歸，得到的方程為y=13.255x+0.912（R2=0.997 6）。說明FRAP法對不同產地黨參多糖鐵離子還原力的測定具有很好的可靠性。

3 結論

由于黨參產地不同導致其多糖含量存在較大差異，其中產自吉林長白山的黨參多糖含量最高，為29.56%±0.15%，青海尖扎次之，甘肅定西黨參多糖含量最低。通過對ABTS自由基、DPPH自由基清除率及鐵離子還原能力等一系列體外抗氧化指標的測定，發現不同產地的黨參多糖抗氧化能力具有一定的差異性，甘肅定西產的黨參多糖雖然含量最低，但是其對ABTS、DPPH自由基清除效果卻最強，吉林長白山產的黨參多糖雖然含量最高，但其對ABTS自由基清除效果卻是最弱的，而青海大通產的黨參多糖鐵離子還原能力最強，說明黨參多糖的體外抗氧化能力與其含量多少關系不大，推測可能主要還是不同的氣候條件及土壤條件致使多糖種類不同造成的。就青海2個產地的黨參多糖而言，青海大通的總體抗氧化效果還是較強的，這可能與青藏高原高寒缺氧的氣候有關，而青海尖扎產的黨參多糖主要對ABTS、DPPH自由基具有較好的清除作用，其對鐵離子還原能力最差，造成青海兩地黨參多糖對鐵離子還原能力差異較大的原因可能是兩地的土壤條件不同使得多糖結構差異較大。從多糖含量和抗氧化能力綜合來說，青海產的黨參品質較優，具有較好的種植前景，這可能與青藏高原高寒缺氧的氣候有關。該研究首次對青藏高原和國內其他不同產地黨參多糖含量及其抗氧化活性進行比較，試驗結果可為黨參多糖的品質評價、種植產地選擇及抗氧化功能性食品開發提供一定的理論依據。

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