南極磷蝦粉培養枯草芽孢桿菌工藝探究

張競競 劉愛慧 孫樂彤 孫建安

摘 要 以南極磷蝦粉作為培養基成分，研究枯草芽孢桿菌高密度培養的最佳工藝條件，為枯草芽孢桿菌微生態制劑的研制奠定理論基礎。以枯草芽孢桿菌數目為指標，使用單因素試驗對培養枯草芽孢桿菌的培養工藝進行優化，從而研究出最佳工藝參數。結果表明，以南極磷蝦粉為培養基成分培養枯草芽孢桿菌的最佳培養條件為：南極磷蝦粉濃度2.5%，接種量10%，裝液量100 mL/250 mL，pH值為8.0，發酵時間3 d。在此培養條件下，枯草芽孢桿菌的活菌數可達到3.6×109 CFU·mL-1。

關鍵詞 南極磷蝦粉;枯草芽孢桿菌;發酵條件;高密度培養

中圖分類號：S963.211 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.23.054

枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，無莢膜，周生鞭毛，能運動，對水產中的弧菌、大腸桿菌和桿狀病毒等有害微生物有很強的抑制作用，能有效預防水產動物腸炎、爛鰓等疾病;既可以分解養殖池中的有毒有害物質，還可以分解池中殘餌和有機物等，具有很強的清理水中小顆粒垃圾的作用;具有活性較強的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，促進飼料中營養素降解和水產類動物對飼料的吸收。

南極磷蝦（Antarctic krill）是生活在南大洋中的一種節肢動物門浮游動物，在南大西洋食物鏈中起到重要作用[1]。南極磷蝦是海洋中一種重要資源，它的利用受到了各國的廣泛關注[2]。因此，最大化發揮南極磷蝦的作用具有非常重要的戰略意義。隨著人們對南極磷蝦的開發與利用的日漸深入，各種磷蝦產品已經面世，如磷蝦蛋白粉、磷蝦油等。南極磷蝦粉是南極磷蝦油提取過程中產生的副產物，含有豐富的蛋白質和礦質元素等營養成分，是一種優質的培養基資源，利用微生物發酵南極磷蝦粉制備微生態制劑也是南極磷蝦粉價值體現的一個方向。微生態制劑在改善宿主健康上起到主要作用[3]，正在全球范圍內的魚類和貝類養殖中獲得越來越高的科學價值和商業價值 。南極磷蝦這一重要資源的開發，可增加資源利用率。

通過單因素試驗，以南極磷蝦粉為唯一營養成分，探討發酵時間、南極磷蝦粉濃度、接種量、發酵液pH值和發酵液裝瓶量5個因素對枯草芽孢桿菌培養效果的影響;以枯草芽孢桿菌的菌數為衡量指標，采用單因素試驗設計方案，進行枯草芽孢桿菌發酵條件的優化，為枯草芽孢桿菌微生態制劑的研制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 原料

南極磷蝦粉，購自青島西海岸遠洋漁業有限公司;枯草芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），購自CICC（中國工業微生物菌種保藏管理中心）。

1.1.2 主要儀器設備

SPX智能型生化培養箱，購自寧波市科技園區新江南儀器有限公司;BCM-1000型超凈工作臺，購自蘇州凈化集團;QYC2112型搖床，購自上海福馬實驗設備有限公司;LDZX-50KA型立式滅菌鍋，購自上海申安醫療器械廠;PL203型電子天平，購自Metteler toledo儀器公司。

1.2 培養條件

1.2.1 種子培養液條件

以自來水配制濃度為3%（w/v）的南極磷蝦粉溶液100 mL，調節其pH為8.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后冷卻，用于培養枯草芽孢桿菌。培養條件為：30 ℃恒溫搖床培養48 h，轉速180 r·min-1。培養結束后，培養枯草芽孢桿菌種子培養液菌數應達到1.6×109 CFU·mL-1。

1.2.2 發酵培養液條件

配制不同濃度的南極磷蝦粉溶液，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min作為發酵培養基，分別在不同培養時間、不同接種量、不同發酵初始pH和不同裝液量條件下進行發酵培養，用于研究枯草芽孢桿菌最適發酵條件。

1.3 探究不同因素對枯草芽孢桿菌菌數的影響

1.3.1 南極磷蝦粉濃度對枯草芽孢桿菌菌數的影響

在5個250 mL三角瓶中分別裝入100 mL南極磷蝦粉發酵培養液，控制南極磷蝦粉濃度分別為1%、3%、5%、10%和15%（w/v）。枯草芽孢桿菌的培養時間為

3 d，分別取培養后的枯草芽孢桿菌菌液進行稀釋并涂布平板，每個稀釋梯度做3次重復操作，并將平板倒置于

30 ℃恒溫培養箱中培養24 h之后計數。試驗平行重復3次，取其平均值，統計枯草芽孢桿菌的數量，分析南極磷蝦粉濃度對枯草芽孢桿菌菌數的影響。

1.3.2 發酵時間對枯草芽孢桿菌菌數的影響

在5個250 mL三角瓶中分別裝入100 mL濃度為5%（w/v）的南極磷蝦粉發酵培養基，調節其pH為8.0。

121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，將枯草芽孢桿菌種子培養液分別以5%（v/v）的比例接入到5瓶發酵培養液中，分別于30 ℃搖床振蕩培養1 d、2 d、3 d、4 d和5 d。其他操作同1.3.1，取其平均值，統計枯草芽孢桿菌的數量，分析發酵時間對枯草芽孢桿菌菌數的影響。

1.3.3 接種量對枯草芽孢桿菌菌數的影響

在5個250 mL三角瓶中分別裝入100 mL5%（w/v）的南極磷蝦粉發酵培養液，將枯草芽孢桿菌種子培養液分別以0.5%、1%、5%、10%和15%（v/v）的比例接入到5瓶發酵培養液中，其他條件與操作同1.3.1，統計枯草芽孢桿菌的數量，分析接種量對枯草芽孢桿菌菌數的影響。

1.3.4 發酵液pH值對枯草芽孢桿菌菌數的影響

在6個250 mL三角瓶中分別裝入100 mL 5%（w/v）南極磷蝦粉發酵培養液，調節其pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，其他條件與操作同1.3.1，統計枯草芽孢桿菌的數量，分析發酵液pH值對枯草芽孢桿菌菌數的影響。

1.3.5 發酵液裝瓶比例對枯草芽孢桿菌菌數的影響

在5個250 mL三角瓶中分別控制5%（w/v）南極磷蝦粉發酵培養液的裝瓶比例為12%、20%、40%、60%和80%，調節其pH值為8.0，其他條件與操作同1.3.1，統計枯草芽孢桿菌的數量，分析發酵液瓶裝比例對枯草芽孢桿菌菌數的影響。

1.4 枯草芽孢桿菌活菌菌數測定

1.4.1 稀釋倒平板法

按10倍稀釋法將培養后的菌液制成不同濃度的稀釋液，從稀釋液中分別吸取100 ?L置于LB固體培養皿中，用無菌涂布棒涂布均勻，每個稀釋度做3次重復操作。將涂布后的平板倒置于30 ℃恒溫培養箱中培養24 h之后，進行菌落計數。

1.4.2 平板計數

選擇適宜的稀釋度，菌落數在30～300個的平板進行計數。

1.4.3 計算方法

芽孢桿菌數（CFU·mL-1）=菌落平均數×稀釋倍數×10。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦粉濃度對枯草芽孢桿菌菌數的影響

南極磷蝦粉濃度對枯草芽孢桿菌菌數的影響如圖1所示。當南極磷蝦粉濃度在1%～3%范圍內時，枯草芽孢桿菌菌數顯著增高;當南極磷蝦粉濃度為2.5%時，枯草芽孢桿菌菌數達到最高值，為9×109 CFU·mL-1;繼續增高南極磷蝦粉濃度時，枯草芽孢桿菌菌數則顯著減少。經統計學分析可知，南極磷蝦粉濃度對枯草芽孢桿菌菌數存在極顯著影響。試驗以南極磷蝦粉為唯一營養成分，進行枯草芽孢桿菌的培養。當南極磷蝦粉的濃度過低時，由于可利用的營養成分過少，菌株生長不良，菌數過少;當南極磷蝦粉的濃度過高時，培養基中的含水量過少，對微生物的生長及代謝能力產生不利的影響。因此，于本研究條件下，枯草芽孢桿菌生長所需的南極磷蝦粉適宜濃度為2.5%。

2.2 發酵時間對枯草芽孢桿菌菌數的影響

發酵時間對枯草芽孢桿菌菌數的影響如圖2所示。發酵時間為1～3 d時，枯草芽孢桿菌菌數極速增長，為增長期;當發酵時間到3 d時，枯草芽孢桿菌菌數達到3.5×109 CFU·mL-1;發酵時間4～5 d時，枯草芽孢桿菌生長進入緩慢增長期，菌數增長緩慢;結果表明，枯草芽孢桿菌的適宜發酵時間為3 d。

2.3 接種量對枯草芽孢桿菌菌數的影響

接種量對枯草芽孢桿菌菌數的影響如圖3所示。枯草芽孢桿菌菌數在接種量為0.5%～10%的范圍內隨接種量的增大而極顯著增大，最大值為5.5×109 CFU·mL-1;當接種量超過10%時，枯草芽孢桿菌菌數則極顯著減少。試驗結果表明，枯草芽孢桿菌的適宜接種量為10%。

2.4 發酵液pH值對枯草芽孢桿菌菌數的影響

發酵液pH值對枯草芽孢桿菌菌數的影響如圖4所示。當發酵液的pH值在5.0～8.0范圍內時，隨著pH值的升高，菌數極顯著增多;pH值為8.0時，枯草芽孢桿菌菌數達最高值為3.4×109 CFU·mL-1;當pH值高于8.0后，枯草芽孢桿菌菌數極顯著減少。這一結果表明，發酵液偏酸或偏堿都不利于枯草芽孢桿菌的生長，枯草芽孢桿菌生長的適宜pH值為8.0。

2.5 發酵液裝瓶比例對枯草芽孢桿菌菌數的影響

發酵液裝瓶比例是通過影響溶氧量對枯草芽孢桿菌的生長產生影響的，發酵液中的溶氧量大小直接影響著菌株的呼吸代謝。發酵液裝瓶比例對枯草芽孢桿菌菌數的影響如圖5所示。當發酵液裝瓶比例為40%時，枯草芽孢桿菌菌數達到最高值為3.6×109 CFU·mL-1。發酵液裝瓶量少，發酵液中的營養物質數量少，不利于菌體生長;反之，裝瓶量大，可能影響容器中的氧含量。由于枯草芽孢桿菌是好氧菌，故容器中的氧含量減少不利于菌體生長。試驗結果顯示，枯草芽孢桿菌生長的適宜發酵液裝瓶比例為40%。

3 結論

以南極磷蝦粉為原料進行研究，基本實現了對培養枯草芽孢桿菌工藝的優化，可以提高南極磷蝦的利用價值。通過多個單因素試驗，并將數據進行對比，從而得出單一變量中培養枯草芽孢桿菌的最適宜條件為：南極磷蝦粉濃度2.5%，接種量10%，pH值8.0，發酵時間3 d，發酵液裝瓶比例40%。

參考文獻：

[1] 黃洪亮，陳雪忠，馮春雷.南極磷蝦資源開發現狀分析[J].漁業現代化，2007，34（1）：48-51.

[2] Delgado GTC， Tamashiro WMDSC， Junior MRM， et al. The putative effects of prebiotics as immunomodulatory agents[J].Food Research International，2011，44（10）：3167-3173.

[3] 胡珊，胡事君，吳清平，等.益生菌制劑加工技術的研究概況[J].中國乳品工業，2010，38（3）：47-50.

（責任編輯：劉昀）