干擾MDM4基因對卵巢癌細胞順鉑耐藥性的影響

張 靖，楊 茹，白惠娟

鄭州大學附屬腫瘤醫院(河南省腫瘤醫院)婦瘤科 鄭州 450008

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，臨床數據[1]顯示，約80%的卵巢癌患者預后不良，表現出鉑類耐藥，導致化療效果不理想。鼠雙微體(murine doubleminute，MDM)4基因位于人類染色體1q32，其編碼的蛋白質在結構上與MDM2蛋白高度同源[2]。多種惡性腫瘤的發生與MDM4基因異常表達密切相關[3]。研究[4]發現MDM4基因在腫瘤化療耐藥中同樣發揮重要作用。Pellegrino等[5]的研究顯示，MDM4通過介導PI3K/AKT途徑參與肝細胞癌的發病和進展。還有研究[6-7]表明，PI3K/AKT途徑的異常激活參與順鉑(DDP)耐藥。本實驗通過沉默MDM4在卵巢癌DDP耐藥細胞A2780/DDP中的表達，觀察細胞對DDP耐藥性及PI3K/AKT信號通路的變化，為進一步闡明卵巢癌DDP耐藥的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1細胞及試劑卵巢癌細胞株SKOV3、A2780及其DDP耐藥細胞株SKOV3/DDP、A2780/DDP均購自中國典型培養物保藏中心；DMEM培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；t-PI3K、p-PI3K、t-AKT、p-AKT、MDM4單抗及IgG二抗均購自美國CST公司；RNA提取試劑盒及反轉錄試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司；蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術研究所；ECL化學發光檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Lipofectamine2000、MDM4 siRNA購自美國Invitrogen公司；MTT購自美國Sigma公司。

1.2細胞培養和轉染SKOV3、A2780及SKOV3/DDP、A2780/DDP細胞均培養于含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素的DMEM培養基中，置37 ℃、體積分數5%CO2、相對濕度為90%的培養箱中培養，細胞貼壁生長至對數生長期，收集細胞用于后續實驗。轉染前1 d將A2780/DDP細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，接種于6孔板中，密度為3×105個/孔，加入不含抗生素、含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基培養過夜，待細胞生長至40%融合時，將特異性沉默MDM4基因的重組載體質粒pLKO.1-puro-GFP-siRNA-MDM4及陰性對照pLKO.1-puro-GFP-siRNA-NC(上海鈺博生物科技有限公司)轉染至A2780/DDP細胞，分別記為MDM4 siRNA組和陰性對照組，將未轉染質粒的A2780/DDP細胞記為空白對照組。每組均3個復孔。

1.3qRT-PCR檢測細胞中MDM4mRNA表達水平分別收集對數生長期的SKOV3、A2780、SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞，用含0、10、20、40 μmol/L DDP的培養基培養48 h的A2780/DDP細胞，以及轉染48 h后的3組A2780/DDP細胞，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，以分光光度計測定RNA濃度和純度，參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板進行擴增， 反應體系20 μL，其中模板0.8 μL、上下游引物各1 μL、2×SYBR Green PCR Mix 10 μL，以ddH2O補足20 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。MDM4上游引物：5’-ACGTTGGATGGA CAACTCAAGTCTAGACCC-3’；下游引物：5’-ACGT TGGATGTGTGTTACCTGTGGCAAGAC-3’。 內參GAPDH上游引物：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’；下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。采用2-ΔΔCt法計算MDM4 mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1.4Western blot法檢測細胞中MDM4、p-PI3K、t-PI3K、p-AKT和t-AKT蛋白表達水平分別收集對數生長期的SKOV3、A2780、SKOV3/DDP和A2780/DDP細胞，用含0、10、20、40 μmol/L DDP的培養基培養48 h的A2780/DDP細胞，以及轉染48 h后的3組A2780/DDP細胞，加入蛋白裂解液，置冰上提取總蛋白。以BCA法檢測蛋白濃度，將蛋白與加樣緩沖液混勻，加熱15 min使蛋白變性。取等量蛋白樣品加入蛋白上樣孔中，行SDS-PAGE電泳，電泳結束后電轉至硝酸纖維素膜上，于含體積分數5%胎牛血清的封閉液中封閉1 h，加入相應的一抗，其中MDM4一抗1∶800稀釋，p-PI3K、t-PI3K、p-AKT、t-AKT一抗均1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫下孵育1.5 h，TBST洗膜3次，加入ECL化學發光液，顯影，采用Quantity One軟件測定蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.5MTT法檢測細胞生長抑制率及耐藥性將3組A2780/DDP細胞用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，分別接種于96孔板中，密度為1×104個/孔，置37 ℃培養箱常規培養24 h，分別加入含0(對照)、10、20、40 μmol/L DDP的培養基，繼續培養48 h后將培養基更換為正常培養基，24 h后每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，去上清液后，每孔加入二甲基亞砜溶液150 μL，置振蕩儀上低速振蕩反應10 min，在酶標儀上于490 nm波長處測定各孔吸光度(A)，計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率=(1-實驗孔A/對照孔A)×100%。繪制生存曲線，計算DDP對各組細胞的IC50。實驗重復3次。

1.6統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析。不同組間MDM4 mRNA和蛋白相對表達量，細胞增殖抑制率，p-PI3K、t-PI3K、p-AKT和t-AKT蛋白相對表達量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同卵巢癌細胞中MDM4表達的比較SKOV3、A2780和SKOV3/DDP、A2780/DDP中MDM4的表達水平見圖1和表1。可知，與卵巢癌細胞相比，卵巢癌DDP耐藥細胞中MDM4 mRNA和蛋白表達水平升高，MDM4在A2780/DDP細胞中表達水平最高，故后續選擇A2780/DDP細胞進行實驗。

1：SKOV3；2：SKOV3/DDP；3：A2780；4：A2780/DDP

細胞nMDM4 mRNAMDM4蛋白SKOV331.00±0.090.26±0.03SKOV3/DDP33.22±0.31?0.47±0.05?A278031.36±0.200.21±0.02A2780/DDP34.62±0.41?#△0.67±0.08?#△F109.54152.343P<0.001<0.001

*：與SKOV3細胞比較，P<0.05；#：與A2780細胞比較，P<0.05；△：與SKOV3/DDP細胞比較，P<0.05

2.2不同劑量DDP作用后A2780/DDP細胞中MDM4表達的比較結果見圖2和表2。隨著DDP劑量的升高，A2780/DDP細胞中MDM4 mRNA和蛋白表達水平逐漸降低。

2.3沉默MDM4對A2780/DDP細胞中MDM4表達的影響結果見圖3和表3。MDM4 siRNA組細胞中MDM4 mRNA和蛋白表達水平均低于空白對照組和陰性對照組。

1：0 μmol/L DDP；2：10 μmol/L DDP；3：20 μmol/L DDP；4：40 μmol/L DDP

圖2不同劑量DDP作用后A2780/DDP細胞中MDM4蛋白的表達

表2 不同劑量DDP作用后A2780/DDP細胞中MDM4 mRNA和蛋白表達的比較

*：組間兩兩比較，P均<0.05

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：MDM4 siRNA組

組別nMDM4 mRNAMDM4蛋白空白對照組31.01±0.100.68±0.07陰性對照組30.98±0.090.65±0.07MDM4 siRNA組30.22±0.03?#0.16±0.02?#F94.94275.206P<0.001<0.001

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與陰性對照組比較，P<0.05

2.4沉默MDM4對A2780/DDP細胞DDP耐藥性的影響結果見表4。不同劑量DDP作用后，MDM4 siRNA組細胞增殖抑制率均高于其他兩組。MDM4 siRNA組的IC50為(10.19±1.62) μmol/L，低于空白對照組的(29.20±3.53) μmol/L和陰性對照組的(25.92±3.28) μmol/L(F=107.882，P<0.001)。

表4 不同劑量DDP作用后各組A2780/DDP細胞增殖抑制率的比較 %

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與陰性對照組比較，P<0.05

2.5沉默MDM4對A2780/DDP細胞PI3K/AKT信號通路的影響結果見圖4和表5。MDM4 siRNA組中p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平均低于其他兩組。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：MDM4 siRNA組

組別np-PI3Kt-PI3Kp-AKTt-AKT空白對照組30.15±0.021.21±0.150.18±0.020.87±0.08陰性對照組30.14±0.021.18±0.110.16±0.020.90±0.09MDM4 siRNA組30.02±0.01?#1.25±0.160.03±0.01?#0.92±0.11F52.3330.18466.3330.214P<0.0010.836<0.0010.813

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與陰性對照組比較，P<0.05

3 討論

卵巢癌是一種發病率和病死率較高的婦科惡性腫瘤，晚期卵巢癌患者5 a生存率低于40%[8]。目前治療晚期卵巢癌的主要方法是以鉑類藥物為基礎的化療，但多數患者對鉑類化療藥物易產生耐藥性，嚴重影響了化療效果。MDM4基因在多種惡性腫瘤中呈高表達，參與腫瘤的發生發展[9]。該研究結果顯示，MDM4在卵巢癌DDP耐藥細胞株的表達水平明顯升高；以不同劑量DDP干預A2780/DDP細胞，結果顯示DDP干預后細胞中MDM4表達水平明顯降低。將MDM4 siRNA轉染到A2780/DDP細胞中，結果顯示，沉默MDM4表達后A2780/DDP細胞增殖抑制率升高，DDP對A2780/DDP細胞的IC50降低，提示沉默MDM4基因能夠降低A2780/DDP細胞對DDP的耐藥性。Wang等[10]研究發現，miR-1307通過靶向MDM4調節細胞凋亡參與乳腺癌DDP耐藥的發展。還有研究[11]顯示，在DDP耐藥的2780CP/Cl-16卵巢癌細胞中，p53(V172F)突變可促進MDM4募集，從而誘導DDP抗性。

PI3K/AKT信號通路與腫瘤化療耐藥密切相關。研究[12]顯示，PI3K/AKT信號通路的活化與DDP、阿霉素等化療藥物的耐藥密切相關。Yan等[13]發現，lncRNA HOTAIR通過靶向miR-126激活PI3K/AKT信號通路，促進胃癌DDP耐藥。目前研究[14]已證實，PI3K/AKT信號通路的過度活化參與卵巢癌細胞DDP耐藥性，抑制該通路能夠明顯降低DDP耐藥性。AKT是PI3K/AKT信號通路的關鍵效應分子，p-AKT可激活下游靶基因表達，進而發揮生物學效應。本研究中發現，沉默MDM4后A2780/DDP細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平顯著下調，提示沉默MDM4能夠抑制PI3K/AKT信號通路的激活。因此推測，沉默MDM4基因的表達可通過抑制PI3K/AKT信號通路而降低A2780/DDP細胞對DDP的耐藥性。

總之，MDM4基因參與卵巢癌細胞對DDP耐藥性，其作用機制可能與提高PI3K/AKT信號通路的活化水平有關。