高效液相色譜法同時測定飲料中的5種添加劑

王林裴，周迎春，鄭亞哲，張亞瓊，李單單，華向美

（1.漯河海關，河南漯河 462000；2.啟迪桑德環(huán)境資源股份有限公司，北京 101012）

食品添加劑是指為改善食品品質和色、香、味，以及為防腐和加工工藝的需要而加入食品中的化學合成或者天然物質[1]。近年來，隨著食品工業(yè)的發(fā)展，食品添加劑使用頻率越來越多，違規(guī)使用或超量使用食品添加劑問題也越頻繁，食品質量安全問題也越來越受到各方的關注。

目前，我國允許使用的食品添加劑種類共23類，包括乳化劑、增味劑、防腐劑、抗氧化劑、著色劑等[2]2 000多種。尤其是飲料的加工制作過程中可允許加入的食品添加劑種類太多，這些添加劑大多沒有營養(yǎng)價值，并且一旦這些添加劑使用量超標，會對人體健康造成危害[3]。例如，當攝入大量防腐劑時，輕則引起流口水、腹瀉、肚子疼痛及心跳加快等癥狀，重則對肝臟、胃和腎臟造成嚴重影響，甚至增大患癌癥風險[4]；苯甲酸鈉會在人體內反應生成苯甲酸而引起慢性苯中毒[5]；食用大量的甜味劑（如糖精鈉等），會影響腸胃消化酶的分泌，降低食欲。因此，檢測食品中添加劑的含量對保障食品安全及維護消費者權益均有重要意義。

安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸是5種常見的食品添加劑，國標沒有規(guī)定同時檢測這幾種防腐劑、甜味劑的檢測方法，而是針對不同的添加劑類別，其對應標準有3個[6-8]，其樣品處理方法不盡相同，過程繁瑣復雜，樣品量較大時，費時耗力效率低，因此建立一種可同時檢測防腐劑、甜味劑的檢測方法顯得尤為關鍵[9]。

目前，已有的檢測食品添加劑的方法有光度法[10]、電位滴定法[11]、毛細管電泳法[12-13]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[14-15]、氣相色譜法[16]等，但是光度法、毛細管電泳法的靈敏度低、分辨率低、操作方法繁瑣；氣相色譜法雖然針對性較強，檢測結果精確度較高，但沒有廣泛的使用范圍[17]；液質聯(lián)用對試驗條件要求較高；液相色譜方法[18-20]最為普遍，有效提升了檢測靈敏度，有較好的分離度和準確度，在食品安全分析檢測中應用廣泛。

試驗針對不同飲料的特點，建立高效液相色譜法同時快速測定飲料中常見食品添加劑的測定方法，將此方法應用于大批量的飲料檢測中具有較高的檢測效率、精密度和準確性，方法穩(wěn)定可靠[21]，也具有較強的實用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿啤、梨汁、水蜜桃汁，市售；乙酸銨（CH3CO2NH4，優(yōu)級純），國藥化學試劑有限公司提供；甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司提供；安賽蜜標準溶液（DRE-C1001800）、糖精鈉標準溶液（DRE-C16901010），Dr.Ehrenstorfer公司提供；山梨酸標準溶液 （BW900997-1000-L，1 000 μg/mL）、苯甲酸標準溶液 （BW900998-1000-L，1 000 μg/mL），壇墨質檢標準物質中心提供；脫氫乙酸標準溶液（21680），北京曼格生物科技公司提供。

注：實驗室用水是由Milli-Q Advantage A10系統(tǒng)制備的高純水，所用容器使用前均用超純水清洗晾干。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290系列（DAD檢測器） 高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；Mill-Q Advantage A10型純水器，美國Millipore科技有限公司產(chǎn)品；MS303S型分析天平，瑞士梅特勒-托利多科技有限公司產(chǎn)品；UV2600型紫外可見光分光光度計，島津公司產(chǎn)品；超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 溶液配制

1.3.1 流動相

溶劑A（0.02 mol/L乙酸銨溶液） 稱取乙酸銨1.54 g，用水溶解，定容至1 000 mL容量瓶，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，超聲脫氣30 min；溶劑B為色譜純甲醇。

1.3.2 亞鐵氰化鉀溶液

稱取106 g亞鐵氰化鉀，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL。

1.3.3 乙酸鋅溶液

稱取220 g乙酸鋅溶于少量水中，加入30 mL冰醋酸，用水定容至1 000 mL。

1.3.4 安賽蜜標準儲備溶液（1 000 μg/mL）

準確稱量安賽蜜標準品0.10 g用水溶解，定容至100 mL容量瓶。

1.3.5 糖精鈉標準儲備溶液（1 000 μg/mL）

準確稱量糖精鈉標準品0.10 g用水溶解，定容至100 mL容量瓶。

1.3.6 脫氫乙酸標準儲備溶液（1 000 μg/mL）

準確稱量脫氫乙酸標準品0.10 g用水溶解，定容至100 mL容量瓶。

1.3.7 5種添加劑混合標準中間溶液（50 μg/mL）

分別吸取安賽蜜、糖精鈉、脫氫乙酸標準溶液儲備液，以及山梨酸、苯甲酸標準溶液2.5 mL用水稀釋定容至50 mL。

1.3.8 5種添加劑混合標準系列工作溶液

分別準確吸取混合標準中間液20，40，100，200，400，1 000 μL，加水定容至 1 mL，分別配制質量濃度為 1，2，5，10，20，50 μg/mL 的混合標準系列工作溶液。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品處理

稱取約5.000 g樣品于50 mL比色管中，加水約25 mL渦旋混勻，含二氧化碳樣品置于超聲清洗儀中超聲處理20 min，不含蛋白質樣品直接加水定容至刻度，含蛋白質樣品分別加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液，5 mL乙酸鋅溶液，然后加水至刻度，混勻，以轉速8 000 r/min離心5 min，將上清液收集經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，上機待測。同樣方法作空白樣。（注：不含蛋白的飲料可以不加如亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液）

1.4.2 色譜條件

色譜柱：Venusil ASB C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；進樣量10 μL，柱溫35℃，DAD檢測器檢測波長230 nm，流動相A 0.02 mol/L乙酸銨溶液，流動相B甲醇，A∶B=95∶5，等梯度洗脫。

1.4.3 標準曲線

將配制好的混合標準系列工作溶液在1.4.2中色譜條件下進行分析，以混合標準系列工作溶液濃度為橫坐標（X）、相應峰面積為縱坐標（Y），繪制標準工作曲線。

1.4.4 添加劑含量的計算

試樣中不同添加劑的含量計算公式：

式中：X——試樣中添加劑的含量，g/kg；

Co——空白樣品中添加劑的質量濃度，μg/mL；

C——樣品中添加劑的質量濃度，μg/mL；

V——試樣稀釋總體積，mL；

m——樣品質量，g；

f——稀釋倍數(shù)；

1 000——換算系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)越性

由于飲料中會不同程度地添加果膠、黃瓜膠、羧甲基醋酸纖維鈉等添加劑來增加口感，因此對有些含乳飲料在前處理過程中需要沉淀蛋白，試驗選擇亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液作為蛋白沉淀劑。與國標不同的是，標準GB/T 23377—2009食品中脫氫乙酸的測定中，針對果蔬汁的測定中需要調節(jié)pH值，用固相萃取柱來提取，過程繁瑣復雜；GB/T 5009.140—2003飲料中乙酰磺胺酸鉀（安賽蜜） 的測定中，樣品處理過程也需要用固相萃取柱上樣、洗脫，過程繁瑣。采用超聲提取方法簡單、便于操作，大大減少了前處理的時間，同時保證結果的準確性。由于這幾種添加劑都易溶于水，且超聲提取過程中可以加快分子運動，加速沉淀劑與溶劑之間的接觸，促使某些成分脫附、溶解，加快提取過程，增大效率，經(jīng)過多次試驗分析得知，超聲提取20 min即可滿足加標回收率要求。

2.2 流動相的選擇

比較了在水/甲醇及乙酸銨溶液/甲醇2種流動相體系下這5種添加劑的分離情況。

流動相乙酸銨/甲醇=90∶10見圖1，流動相水/甲醇=90∶10見圖2。

圖1 流動相乙酸銨/甲醇=90∶10

圖2 流動相水/甲醇=90∶10

由圖1和圖2可看出，乙酸銨/甲醇作為流動相時，分離效果較為理想。甲醇/水作為流動相時，各組分出峰較為密集，峰型較差，不能得到有效分離。而乙酸銨/甲醇作為流動相時，分離效果理想，且峰型尖銳且對稱，與甲醇/水體系相比靈敏度也有所提高，因此選擇乙酸銨/甲醇體系作為流動相。調整流動相比例來改善峰型及出峰時間，由分析可知，甲醇為10%時，這幾種添加劑分離效果及峰型相對較好，因此確定流動相比例為乙酸銨∶甲醇=90∶10（V∶V）。

2.3 檢測波長的選擇

多種物質同時檢測時，不僅要保證每種組分的靈敏度，還需定量方法簡便。試驗采用分光光度計在190~400 nm范圍內對各組標準溶液進行光譜掃描，分析安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸這5種添加劑的吸光度圖譜可知，這5種組分的最大吸收波長依次為228，220，226，254，235.5 nm。為兼顧各組分的檢測靈敏度，最終選擇230 nm作為檢測波長，此條件下繪制檢測色譜圖，可以完全分離，且分離效果較好。

5種添加劑的標準色譜圖見圖3。

圖3 5種添加劑的標準色譜圖

2.4 線性方程、檢出限及混合標準溶液色譜圖

將安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸混標工作液液稀釋成質量濃度分別為1，2，5，10，20，50 μg/mL混標溶液，分別進樣 10 μL通過色譜條件來進行測定，以峰面積為縱坐標，各組分的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。取標品逐級稀釋進行檢測，確定5種添加劑的檢出限（以3倍信噪比計算，即S/N=3）和定量限（以10倍定量限計算，即S/N=10）。

5種食品添加劑的標準曲線見表1。

結果表明，各組分在線性范圍內均有良好的線性關系，方法檢出限為1.0~2.5 mg/kg，定量限為1.5~4.5 mg/kg。

2.5 方法精密度和重現(xiàn)性試驗

準確稱量7份空白樣品平行試樣，分別向其中加入等量混標溶液，使得各組混標溶液質量濃度為20 μg/mL，根據(jù)試驗方法對樣品進行處理后測定，以峰面積對取得的測定值進行表示。

方法精密度結果見表2。

經(jīng)計算，得到5種添加劑的相對標準偏差為0.03%~0.29%，說明該方法準確可靠。

表1 5種食品添加劑的標準曲線

表2 方法精密度結果（n =7）

2.6 加標回收試驗

以3種不同的飲料樣品為基質，向其中加入5種添加劑混標溶液，做10 μg/mL和80 μg/mL 2個質量濃度水平的加標回收試驗。

樣品中5種食品添加劑的加標回收率見表3。

表3 樣品中5種食品添加劑的加標回收率

由表3可知，5種添加劑在不同質量濃度水平的加標回收率分別為89.3%~94.2%，85.2%~93.8%，85.7%~92.4%，81.9%~92.5%，84.3%~90.0%，均滿足國標GB/T 27404—2008中對回收率的要求。

2.7 方法準確度驗證

采用飲料中安賽蜜定量分析質控樣QC-FJ-705和果蔬汁中山梨酸、苯甲酸定量分析質控樣QC-FJ-706來驗證方法準確度.

實際樣品測定結果見表4。

表4 實際樣品測定結果/mg·kg-1

由表4可知，該方法對飲料中山梨酸和苯甲酸、安賽蜜測定結果能與標準值保持一致。與2.6部分加標回收率結果證明了該方法準確度較高，結果穩(wěn)定可靠。

質控樣QC-FJ-706的色譜圖見圖4，質控樣QC-FJ-705色譜圖見圖5。

圖4 質控樣QC-FJ-706的色譜圖

圖5 質控樣QC-FJ-705色譜圖

2.8 實際樣品測定

采用優(yōu)化后的儀器條件和操作方法對當?shù)爻槿∈惺鄣?5種飲料各3批次，分別進行5種添加劑含量的檢測。

不同飲料中5種添加劑含量的測定結果見表5。

表5 不同飲料中5種添加劑含量的測定結果/g·kg-1

根據(jù)表5中測定結果，不同類別的飲料所含添加劑種類、含量有所不同。根據(jù)國家標準GB 2760—2014[1]中食品添加劑使用標準中規(guī)定，飲料類中安賽蜜最大使用量為0.3 g/kg；對于山梨酸及其鉀鹽的含量，乳酸菌飲料最大使用量為1.0 g/kg，飲料類最大使用量為0.5 g/kg；對于苯甲酸及其鈉鹽果蔬汁（漿）類飲料不超過1.0 g/kg，蛋白飲料不超過1.0 g/kg，碳酸飲料不超過0.2 g/kg，茶、咖啡、植物（類）飲不超過1.0 g/kg，特殊用途飲料不超過0.2 g/kg，風味飲料不超過1.0 g/kg；冷凍飲品中糖精鈉含量不得超過0.15 g/kg；果蔬汁（漿）中脫氫乙酸含量不大于0.3 g/kg，被抽檢飲料中所含這5種添加劑均在國標允許范圍內添加，沒有發(fā)現(xiàn)有超標使用情況。

3 結論

采用高效液相色譜檢測法，可同時測定飲料中安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸這5種常見的食品添加劑，檢測結果準確、分析時間短，具有較高的靈敏度和準確度，且方法操作簡單、實用性強，能夠滿足實際工作的需要，為食品監(jiān)管部門、企業(yè)等檢測機構提供技術支持。