兩種檢測生鮮乳中β-內酰胺酶的方法比對

郝苗苗 ，徐偉良 ，3，李春冬 ，3， 孫春玲

（1.錫林郭勒職業學院，內蒙古錫林浩特 026000；2.錫林郭勒食品檢驗檢測和風險評估中心，內蒙古錫林浩特 026000；3.錫林郭勒生物工程研究院，內蒙古錫林浩特 026000）

乳及乳制品在生產、加工過程中抗生素的殘留嚴重危害人體健康[1-3]。近年來，隨著國家對生鮮乳品質監控力度加大，一些不法分子為了謀求經濟利益，通過人為添加β-內酰胺酶以分解乳中的抗生素類藥物，使“高抗奶”變為“無抗奶”[4]。2001年9月，我國農業部頒布了《無公害食品生鮮牛乳》行業標準，規定生鮮乳中“不得檢出”抗生素[5]。衛生部于2009年3月發布了《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治近期工作重點及要求》和《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治抽檢工作指導原則和方案》的通知，明確指出β-內酰胺酶是非食品用物質且屬違法添加劑。

常用的β-內酰胺酶檢測方法主要有微生物法、理化檢測法、儀器檢測法、免疫法和試劑盒檢測等方法。現今常使用的檢測方法為微生物法中的杯蝶法[6-9]、快速檢測的試劑盒法[10-12]，2種方法各有優缺點。因此，試驗研究對比杯蝶法與試劑盒法的差異，以供人們在檢測過程中根據實際需求選擇最優方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣品為10份生鮮奶樣；藤黃微球菌（Micrococcus luteus） CMCC（B）28001，中國醫學細菌保藏管理中心提供；β-內酰胺酶標準品（600萬U/mL），中國食品藥品檢定研究院提供；青霉素G標準品（99.8%）、舒巴坦（99.4%），Dr.Ehrentorfer公司提供；0.1 mol/L Tris-HCl溶液（pH值7.0，含 0.1%BSA）；抗生素檢定培養Ⅱ號、營養瓊脂、腦心浸液培養基，北京陸橋公司提供；無水磷酸二氫鉀，無水磷酸氫二鉀，國藥公司提供；β-內酰胺酶殘留試劑盒，勤幫生物技術有限公司提供。

1.2 杯蝶法[6]

1.2.1 菌懸液的制備

將藤黃微球菌劃線接種于營養瓊脂平板上，于36℃下培養24~36 h直至長出單個菌落。挑取單菌落于無菌的5 mL腦心浸液培養基，經36℃下培養20~24 h至菌液渾濁，測定菌懸液濃度在1×108~1×109CFU/mL，菌懸液應在4℃下保藏5 d內使用。

1.2.2 樣品的制備

將待檢樣品充分混勻，取1mL待檢樣品分別置于4支1.5 mL離心管中，分別標為A，B，C，D，每個樣品做3個平行，共12管。同時做陽性對照和陰性對照樣品，陽性對照樣品為滅菌后并經檢測為陰性的牛乳，經添加β-內酰胺酶標準品至終質量濃度為0.5 U/L。陰性對照樣品為滅菌后并經檢測為陰性的牛乳。制備操作同待檢樣品。

1.2.3 檢測用平板的制備

菌懸液按1∶20加入到無菌約50℃的抗生素檢定培養基Ⅱ號中，充分搖勻。取無菌培養皿，加入15 mL含菌的抗生素檢定培養基Ⅱ號，凝固后在其表面放置4個無菌牛津杯，備用。

1.2.4 樣品的測定

各離心管標準物質添加量見表1。

表1 各離心管標準物質添加量

按照表1分別將青霉素G標準溶液、β-內酰胺酶標準溶液、舒巴坦標準溶液加入到待檢樣品及陽性/陰性對照樣品中。混勻后，將上述A~D試樣各取200 μL加入放置于檢測用平板上的4個無菌牛津杯中，于36℃下培養18~22 h，測量抑菌圈直徑。每個樣品取3次平行試驗平均值。

1.2.5 結果判定

陰性對照樣品應A，B，D產生抑菌圈，且A，B抑菌圈直徑差異<3 mm，C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，且抑菌圈直徑差異≥3 mm，且3次平行試驗結果一致。陽性對照樣品應B，D產生抑菌圈，且A抑菌圈直徑小于B抑菌圈直徑，差異≥3 mm，C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，且抑菌圈直徑差異≥3 mm，且3次平行試驗結果一致。以對照組結果為前提，檢測系統成立，可對樣品結果進行如下判定：

（1） 若樣品結果中B，D產生抑菌圈，且C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，抑菌圈直徑差異≥3 mm，3次平行試驗結果一致時，進行如下判定：①A抑菌圈直徑小于B抑菌圈直徑，差異≥3 mm，3次平行試驗結果一致，則判定該樣品檢出β-內酰胺酶，報告β-內酰胺酶檢測結果為陽性。②A，B抑菌圈差異<3 mm，3次平行試驗結果一致，則判定該樣品未檢出β-內酰胺酶，報告β-內酰胺酶檢測結果為陰性。

（2）當樣品結果中A不產生抑菌圈且B產生的抑菌圈<11 mm或A、B均不產生抑菌圈，應將樣品稀釋10倍，再按照該方法進行檢測。

1.3 試劑盒法

將樣品與試劑條恢復至室溫，迷你金屬浴提前預熱至35℃。從試劑桶中取出白色微孔試劑，開蓋，吸取250 μL均勻樣品至該微孔中，充分混勻，蓋好蓋板膜。將微孔放入45±5℃的恒溫箱，保溫15 min，取出后回溫3 min。取出試劑桶，打開后取出所需的紅色微孔試劑和試紙條并標記。用微量移液器吸取200 μL待檢樣本于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻，將微孔放入迷你金屬孔中，孵育3 min。在35℃條件下，將試紙條插入微孔中一手柄端向上，吸水墊端向下，并使吸水墊充分浸入溶液中，反應3 min。從微孔中取出試紙條，輕輕刮去試紙條下端的吸水墊，并進行結果判讀。反應完成5 min內讀取結果。

2 結果與分析

分別采用杯蝶法與試劑盒法對10份生鮮乳進行β-內酰胺酶檢測。

杯蝶法與試劑盒法結果見表2。

表2 杯蝶法與試劑盒法結果

由表2可以看出，10份樣品經杯蝶法檢測有3份陽性樣品，陽性檢出率為42.9%。用試劑盒法可檢測出1份陽性樣品，陽性檢測率為10%，檢出率低于杯蝶法。與試劑盒檢測相比杯碟法檢測時間過長。

3 結論

杯蝶法是微生物法測定β-內酰胺酶的主要方法，該法采用對青霉素類藥物絕對敏感的藤黃微球菌作為標準菌株，在樣品中加入青霉素G作為對照，利用舒巴坦特異性抑制β-內酰胺酶活性的特性，通過比對加入舒巴坦與未加入舒巴坦的樣品所產生抑菌圈的大小，間接測定樣品中是否含有β-內酰胺酶類藥物。此方法對樣品進行3個平行測試，重復性好，陰陽性對照均符合標準要求，適合大批量檢測，檢測結果相對準確。

試劑盒法利用間接競爭法測定β-內酰胺酶，其基本原理是β-內酰胺酶可分解β-內酰胺類抗生，通過快速測定β-內酰胺反應后殘留的酶含量，從而檢測牛奶中殘留的β-內酰胺。根據樣本中β-內酰胺酶含量的變化可使檢測試劑條發生顏色深淺的變化，從而進行測定。此方法適用于現場的快速檢測，對環境要求不高，檢測速度雖快但易出現假陰性結果，如需進行確證仍應按照標準的微生物杯蝶法進行確證。