微泡介導超聲空化聯合自然殺傷細胞對兔肝VX2腫瘤熱消融的增效作用

韓 璐，郭 凱，鄭 瑜，趙 潔，王曉武，鄭 靜，劉紅崗

(1.西安市中心醫院超聲診斷科，西安 710003；2.陜西省人民醫院胸外科，西安 710068；3.空軍軍醫大學唐都醫院胸腔外科，西安 710038；4.空軍軍醫大學西京醫院心臟外科，西安 710032)

近年來，超聲引導熱消融技術在肝腫瘤的治療中取得了良好的效果。它使腫瘤組織通過熱效應產生凝固性壞死[1]。但由于非均勻溫場的出現，使局部治療溫度降低，造成局部腫瘤細胞存活[2]。殘留腫瘤細胞可在腫瘤內新生血管及炎性微環境的共同支持下重新增殖，成為熱消融術后肝腫瘤復發的一個重要原因。因此，抑制熱消融術后腫瘤炎性微環境及阻斷腫瘤新生血管，對減少術后腫瘤細胞殘余，降低腫瘤復發具有重要意義。

腫瘤組織的新生血管具有管壁薄弱等特點，對微泡介導的超聲空化效應尤為敏感。空化效應不僅可以阻斷微血管血供，而且可以減少腫瘤血管對熱消融造成的“熱沉降效應”[3]。與此同時，NK細胞在抑制腫瘤炎性微環境中發揮著積極作用，同時可誘導腫瘤細胞的凋亡。而在原發性肝癌的發生、發展過程中普遍存在NK 細胞數量減低、功能缺陷，亞型變化等改變[4-5]。因此，本研究建立兔肝VX2腫瘤模型，旨在通過微波熱消融、微泡介導超聲空化聯合NK細胞，提高熱效應的同時，抑制腫瘤炎性微環境，達到減少腫瘤殘余的目的。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級2～4月齡健康的新西蘭大白兔40只，普通級3月齡VX2腫瘤的荷瘤兔1只(腫瘤已種植于兔腿部)，均購自空軍軍醫大學實驗動物中心[SCXK (軍)2017-0022]，體重1.5～2.5 kg，雄性。實驗兔飼養于空軍軍醫大學驗動物中心普通環境[SYXK (陜)2017-0043]，溫度為20℃～25℃，相對濕度為60%～70%。本實驗經過西安交通大學附屬市中心醫院醫學倫理委員會的批準，批準號為2019XAKY-013。并根據3R原則對實驗動物的使用和飼養給予人道關懷。將實驗兔隨機分為：微波熱輻照消融組(MW)，超聲空化輻照組(CA)，NK細胞注射組(NK)，微波消融聯合超聲空化及NK細胞注射組(MW+CA+NK)和無輻照無注射空白對照組(BL)，每組8只。

1.2 主要試劑與儀器

CZ-960 A型高聲壓超聲無創治療儀(四川綿陽索尼克電子有限責任公司)，治療探頭頻率831KH，平均聲強1.5 W/cm2，峰值負壓4.6 MPa，占空比0.22%，采取交替治療模式：工作6 s、間歇6 s。微波治療儀ECO-100C(南京億高微波系統工程有限公司)，工作頻率為2430～2470 MHz，輸出功率0～150 W可調節，采用A型治療針頭，針頭長度為3 mm。超聲成像儀器采用Mylab90(ESAOTE, Italy)，L522探頭，頻率5～12 MHz。

超聲造影劑采用SonVue(Bracco, Italy)微泡平均直徑為2.5 μm。T75、T175細胞培養瓶，離心管，巴氏滴管及CO2細胞培養箱、離心機均為美國賽默飛公司產品；倒置顯微鏡及Cell Counter model R1自動細胞計數儀均為日本Olympus 公司產品；兔原代NK細胞、原代NK細胞基礎培養基及原代NK細胞培養添加劑均購自上海通蔚生物科技有限公司。胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，青霉素/鏈霉素購自美國Hyclone公司。

戊巴比妥鈉(長春軍需畜牧研究所)，注射用青霉素鉀(山東魯抗醫藥股份有限公司)，吸收性明膠海綿(金陵藥業股份有限公司南京金陵制藥廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 兔VX2肝腫瘤模型建立

在超聲引導下，將2～3塊3～5 mm3來自荷瘤兔的VX2腫瘤組織通過16G穿刺針種入兔肝內[6]。采用二維超聲于14 d后進行檢測，兔肝內出現類圓形稍低回聲區，為種植成功。

1.3.2 NK細胞擴增培養及細胞計數

兔原代NK細胞使用含10%胎牛血清，NK細胞培養添加劑及青霉素/鏈霉素雙抗的完全培養基，常規培養于37℃，5% CO2細胞培養箱。培養過程中每天對NK 細胞觀察，當細胞密度在80%～90%時進行傳代，傳代次數不超過5代。將細胞培養產物1000 r/min離心5 min去上清并用PBS重懸，使用Cell Counter model R1自動細胞計數，調整終濃度為2.5×106個/mL。

1.3.3 各組動物VX2腫瘤干預方法

將荷瘤兔經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉固定后：MW 組：超聲引導下將微波針穿刺入腫瘤內實質區，治療功率30 W，采取治療1 min，間歇1 min，同時使用超聲治療探頭無空化輻照治療10 min；CA組：經兔耳緣持續泵入8 mL，SonVue 0.8 ml/min，同時使用超聲治療探頭進行空化輻照治療10 min(Flash模式，功率100%)；NK組：經兔耳緣持續泵入8 mL，NK細胞懸液 0.8 mL/min，同時使用超聲治療探頭無空化輻照治療10 min；MW+CA+NK組：超聲引導下將微波針穿刺入腫瘤實質區，治療功率30 W，采取治療1 min，間歇1 min；經兔耳緣持續泵入8 mL，SonVue 0.8 ml/min，同時使用超聲治療探頭進行空化輻照治療10 min(Flash模式，功率100%)；生理鹽水沖管后，經兔耳緣持續泵入8 mL，NK細胞 0.8 mL/min，同時使用超聲治療探頭假空化輻照治療10 min。空白組：不予任何處理。各實驗組治療后均肌注青霉素2 mL。分別于術后10 d處死動物。

1.3.4 療效評價

(1)二維灰階超聲：治療前后，觀察腫瘤形態、位置，分別測量左右徑、上下徑、前后徑，計算腫瘤體積=π/6×左右徑×上下徑×前后徑。

(2)彩色多普勒血流成像(Color Doppler Flow Imaging, CDFI)和超聲造影(Contrast Enhanced Ultrasonography, CEUS)：治療前后，采用CDFI評價腫瘤內部血流分布，分級：0級：未見明顯血流信號；I級：可見點狀血流信號；II級：短棒狀血流信號；III級：環狀血流信號。CEUS成像：選取腫瘤最大切面，固定探頭，經兔耳緣靜脈以團注法注射SonVue(0.2 mL/kg)，隨之注射2 mL生理鹽水沖管，同時儲存動態造影圖像。采用CEUS評價治療前后各組腫瘤內血流分布，分級：0級：無血流灌注；I級：內部點狀血流灌注；II級：內部條狀血流灌注；III級：內部片狀血流灌注。觀察各組術后造影圖像，截取腫瘤最大平面，測量腫瘤最大徑。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 兔肝VX2腫瘤生長變化

2.1.1 二維灰階超聲觀察結果

術前，兔VX2肝癌表現為低回聲結節(圖2 A)。術前各組腫瘤體積無明顯統計學差異(P>0.05)，10 d后MW+CA+NK組與其他組相比較，腫瘤體積明顯縮小(P<0.05，圖1A)。MW組、NK組術后腫瘤體積均小于BL組(P<0.05，圖1A)。CA組與BL組術后體積無統計學差異(P>0.05)。

2.1.2 CEUS測量結果

各組術前最大徑分別為MW+CA+NK組(1.29±0.34)cm，MW組(1.41±0.54)cm；NK組(1.54±0.38)cm，CA 組(1.55±0.33)cm，BL組(1.31±0.25)cm。術前各組最大徑無統計學差異(P>0.05)；術后最大徑分別為MW+CA+NK組(1.35±0.41)cm，MW組(2.49±0.36)cm，NK 組(2.53±0.76)cm，CA組(2.63±0.58)cm，BL組(2.84±0.56)cm。MW+CA+NK組術后最大徑小于其他各組(P<0.05，圖1B)。

2.2 CDFI評價治療后腫瘤血流

兔肝VX2腫瘤治療超聲圖像如圖2所示。采用CDFI觀測治療前各組腫瘤血流灌注，均可見豐富的血流信號(圖2C)，治療前CDFI評估各組腫瘤血流灌注差異無統計學意義(P>0.05)。治療后，MW+CA+NK組6例腫瘤治療區未見明顯彩色血流信號，2例腫瘤在治療區邊緣發現點狀殘存血流(圖2D)；經統計分析可見MW+CA+NK組術后血流明顯減低，具有顯著統計學意義(P<0.05，表1)。

2.3 CEUS評價治療后腫瘤血流灌注

治療前CEUS示各組兔肝腫瘤，血流信號豐富，成高灌注狀態，并且表現為肝腫瘤典型的“快進快出”征象。治療前CEUS評估5組腫瘤血流灌注無統計學差異(P>0.05)。治療后，各組造影所示血流灌注分布(表1，圖3)，經統計分析可見MW+CA+NK組術后血流明顯減低，具有顯著統計學意義(P<0.05)。

注：A：腫瘤體積；B：腫瘤最大徑。

注：A：治療前，灰階超聲示腫瘤呈不均質低回聲(箭頭)；B：治療后，灰階超聲示消融區內片狀分布粗大點狀強回聲(箭頭)；C：治療前，CDFI示腫瘤內環狀血流信號(箭頭)；D：治療后，CDFI示消融區內血流信號消失，邊緣可見殘留點狀血流信號(箭頭)。

注：A：MW+CA+NK組治療區域無明顯血流灌注；B：MW組治療區域周邊可見少許“點狀”血流灌注(箭頭)；C：NK組治療區域可見腫瘤中心部位有“條狀”血流灌注(箭頭)；D：BL組治療區域可見腫瘤內部位有“片狀”血流灌注(箭頭)。

表1CDFI及CEUS觀察各組治療后VX2肝腫瘤內血流分布特征

Table1Distribution of blood flow in VX2 liver tumors after treatment as assessed by CDFI and CEUS

組別GroupsCDFICEUS0級Grade 0I級Grade III級Grade IIIII級Grade III0級Grade 0I級Grade III級Grade IIIII級Grade IIIMW+CA+NK62007100MW?01430152NK?01250035CA?00440053BL?00170008

注：結果以腫瘤個數表示。與同一時間段MW+CA+NK組相比，*P<0.05。

Note.Results are expressed as the number of tumors.Compared with the MW+CA+NK group in the same time period,*P<0.05.

3 討論

目前超聲引導下熱消融治療已被臨床廣泛認可，但受腫瘤大小、位置等因素影響，常導致消融不徹底、腫瘤易復發等不良后果。殘留腫瘤細胞必須在其賴以生存的“土壤”-腫瘤微環境支持下生長發展。其中，由炎性細胞和促炎因子網絡組成的炎性微環境發揮著重要作用。腫瘤微環境是一個由多種異形細胞相互作用而形成的復雜綜合系統，對腫瘤發生發展起到了誘導，轉化，支持和促進作用。巨噬細胞廣泛參與機體炎癥反應，與炎性微環境和腫瘤發生發展都有密切關系，通過分泌表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板衍生因子和TGF-β等細胞因子促進腫瘤細胞增殖和存活，并能提供促血管生成微環境[7]。Granot 研究證實[8]：腫瘤微環境活化的NK 細胞能刺激巨噬細胞的MHC-Ⅱ(major histocompatibility complex classⅡ)表達，促使腫瘤相關巨噬細胞M2 型向M1 型轉化，增加抗腫瘤相關巨噬細胞M1 型的數量。同時，活化的NK 細胞分泌IFN-γ(inerferon-γ)，IFN-γ進一步誘導巨噬細胞MHC-Ⅱ表達，逆轉腫瘤微環境的免疫抑制情況[9-10]。在原發性肝癌疾病中NK細胞的數量減少，亞型也發生變化，提示NK 細胞的功能缺陷與肝癌的進展密切相關[11-12]。超聲造影劑進入血液后在超聲脈沖作用下可成為有效的空化核，誘導超聲空化，引起鄰近細胞及組織的損傷，同時微泡爆破能夠使局部毛細血管和細胞膜通透性增高[13]。本研究通過建立兔VX2肝腫瘤模型，微波消融肝腫瘤同時通過超聲靶向輻照微泡爆破增加血管內皮系統通透性，并阻斷腫瘤組織的新生血管[14]。將NK細胞輸送至肝，提高肝組織局部NK細胞數量，改善NK細胞亞型的比例失衡；并采用局部超聲空化，使NK細胞能夠更快進入癌巢中心，通過調節肝內炎性微環境，逆轉腫瘤微環境的免疫抑制，最終減少消融后殘留。國內研究發現，微波消融可增強原發性肝癌患者的細胞免疫功能，促使患者外周血NK細胞，IFN-γ、TNF-α等水平較治療前顯著提高[15]。黃慶生等提出NK 細胞在抗病毒、抗腫瘤上扮演著重要的角色，因其作用不需初次免疫活化，因而在過繼免疫治療(adoptive cellular immunotherapy，ACI)上有其獨特的應用前景。但由于不能獲得數量大、純度高的NK細胞，使NK細胞在免疫治療中的應用受到了限制[16-17]。本研究結果發現治療后NK組體積較BL組減小1.9倍，CA組體積較BL組減小1.3倍，MW+CA+NK組體積較BL組明顯減小7.2倍。說明通過ACI療法增加NK細胞數量及純度可抑制腫瘤增長；而單純的微泡介導的空化效應可以阻斷腫瘤新生血管，局部形成微血栓等功效限制腫瘤的生長；而將微波消融聯合微泡介導的空化效，同時給予NK細胞ACI治療后，達到了熱效應、生物效應與免疫效應多重治療方法聯合作用于肝腫瘤，發揮各自優勢，有效抑制腫瘤生長。

本研究采用CEUS測量的腫瘤最大徑與灰階超聲測量腫瘤體積結果相同，MW+CA+NK組體積及最大徑較其他各組減低。超聲造影劑走形于血管腔內，不進入組織細胞間隙[18-19]，可對壞死組織與正常組織明顯分界，使結果更為精確，兩種評估模式均證實MW+CA+NK組可有效抑制腫瘤生長。

通過CEUS評價治療后各組血流灌注結果，可見MW+CA+NK組較各實驗組血流明顯減低。其余各組在治療后均出現了3例以上的“條狀”、“片狀”血流灌注；MW+CA+NK組在治療后僅出現1例“點狀”血流灌注，其余7例均無明顯血流灌注。說明MW+CA+NK組可有效減少了腫瘤的殘余。在顯示血流灌注方面，CDFI和CEUS均可顯示殘余腫瘤內部的血流狀況，但熱消融治療后存在氣化現象，并且受腫瘤位置及血流速的影響，CDFI對檢測術后殘余腫瘤組織的血流灌注敏感性較低[20]。CEUS對血流灌注較為敏感，可顯示熱消融治療后殘余腫瘤組織中血流灌注程度及位置，因此CEUS對于術后評估殘余腫瘤更為準確。

綜上所述，本研究建立兔肝VX2腫瘤模型，采用微波消融、微泡介導超聲空化聯合NK細胞的治療方式，有效抑制兔VX2腫瘤生長，減少腫瘤殘余。并對腫瘤生長微環境實施干預，為減少熱消融后腫瘤殘留提供新策略，為提高熱消融療效尋找新思路。