小鼠原發性肝癌模型的建立與優化

孫振宇，武鴻彪，劉 寧，徐胤淇，周 健，陳雪健，王 偉，徐力善，袁旦平*

(1.寧波市第一醫院，浙江 寧波 315000；2.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院，哈爾濱 150001；3.軍事科學院軍事醫學研究院生物工程研究所，北京 100850)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為肝的原發惡性腫瘤，每年全世界上有超過50多萬人被診斷為HCC[1-2]，HCC是由一系列相關病毒感染以及其他相關因素，諸如高度酒精、糖尿病及其并發癥和黃曲霉毒素暴露等引起的慢性疾病進展而來[3-4]。HCC的發生與發展是一個多步驟多因素的過程，其中涉及到多種基因蛋白，這些基因蛋白包括p53和b-連環蛋白等等[5]，它們與細胞的增殖、細胞周期的進程，以及細胞的凋亡與侵襲有著極其密切的相關性。受到生長因子調節的信號通路[6]，細胞分化相關通路和血管生成誘導的信號通路也可以促進HCC的發生與發展。另外，相關基因的改變也可以導致HCC的發生。二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)是一種具備高度遺傳毒性的致癌物質，研究人員通過比較基因組學分析之后得知DEN所誘導的肝癌模型中的基因表達與人類肝細胞癌的患者肝組織類似[7]。研究表明DEN在小鼠的體內最終可以轉化成為烷基化代謝物，此代謝物可以導致DNA加合物的形成，隨后轉化成中間體，促使了甲基化，DEN的成瘤過程中最關鍵的是由于DNA中的O6與N-7甲基鳥嘌呤的形成，使得遺傳信息的改變，形成啟動致癌的細胞[8]。合理有效的建立原發性肝癌動物模型是研究肝細胞癌發生發展及致病機制的重中之重，目前常用的肝癌動物模型通常選用小鼠(BALB/c、C57BL/6、ICR)，目前誘導小鼠肝癌常用化學誘導法，采用DEN溶液或DEN與CCl4聯用對小鼠腹腔注射進行肝癌建模，此方法經濟節約，操作簡便，穩定性高，可以避免因小鼠個體差異帶來的誤差，較好的模擬了肝癌在人體中自然形成過程。而目前腹腔注射法存在誘癌時間較長的缺點。本文旨在較短的時間內，成功建立小鼠肝癌模型，在此基礎上衡量各自的優缺點，克服難點，更精準更合理的進行小鼠肝癌造模，為研究肝癌的發生與發展奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6雄性小鼠80只，14～16日齡，體重約為4 g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK (京)2016-0011]。飼養于軍事科學院軍事醫學研究院生物工程研究所實驗動物中心[SYXK (軍)2016-0010]，恒溫恒濕，濕度(60±5)%，溫度24℃，光照遵循晝夜節律，每籠飼養5只C57BL/6小鼠。本實驗通過哈爾濱醫科大學實驗動物中心和實驗動物倫理委員會批準(110052018016)，并且嚴格按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義的關懷照顧。

1.2 主要試劑與儀器

二乙基亞硝胺(DEN，Sigma公司)；四氯化碳(CCl4，Sigma公司)；甲胎蛋白(AFP)與高爾基體蛋白73(GP73)ELISA試劑盒(北京熱景生物技術股份有限公司)。全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)；-80℃冰箱(海爾公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗小鼠的分組及造模

將實驗小鼠隨機分為4組，每組20只，分別命名為低劑量DEN組、高劑量DEN組、DEN+CCl4組、對照組，隨后分籠飼養。低劑量DEN組腹腔注射DEN(25 mg/kg)。高劑量DEN組腹腔注射DEN(40 mg/kg)。DEN+CCl4組腹腔注射DEN(2 mg/kg)，兩周后腹腔注射CCl4(5 mL/kg,20%),每周給藥2次共16周。對照組不予染毒處理，飼養環境及飲食飲水與實驗組保持一致。在造模的第24周集中麻醉斷頸法處死各組小鼠，剖開腹腔，取得肝樣本拍照，將部分肝組織凍存于-80°C冰箱中備用，比較各組間肝的外觀，腫瘤的發生率，及腫瘤的大小與面積占比。

1.3.2 各組實驗小鼠的存活狀態及存活時間的觀察

各組小鼠造模后觀察小鼠的存活情況，如有小鼠死亡，則詳細記錄死亡時間，繪制存活曲線，比較各組差異。

1.3.3 小鼠血清ALT和AST的檢測

在造模的第24周集中麻醉斷頸法處死各組小鼠，收集血液標本并置于37°C溫箱放置30 min。隨后將收集的小鼠血液2000 r/min離心10 min以收集足量的血清，分別取100 μL小鼠血清存放入EP管中注明各組組別并送至北京武警總醫院生化分析室，使用全自動生化分析儀檢測。

1.3.4 小鼠血清GP73、AFP的檢測

按照1.3.3方法取得足量小鼠血清，使用鼠源GP73、AFP的ELISA試劑盒，體外定量檢測鼠血清中GP73、AFP的表達水平(酶聯免疫吸附技術)。具體的操作方法嚴格遵循試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠的生存曲線統計與分析

生存曲線的統計時間為24周，從造模開始直至第24周造模結束。由圖1可知低劑量DEN組與高劑量DEN組小鼠DEN染毒后造模開始的1周內死亡率較高，第2周直至第24周兩組小鼠幾乎無死亡，而DEN+CCl4組小鼠在造模初期無死亡，直至造模第4周后開始呈現出較高的死亡率(P<0.001)。

注：各組小鼠的存活曲線比較。

2.2 各組小鼠肝樣本肉眼觀察

在造模過程中，低劑量DEN組、高劑量DEN組、DEN+CCl4組小鼠均出現食欲不振、體重下降、精神萎靡、退毛等等非正常現象，而對照組的小鼠精神狀態良好，毛發光亮，食欲佳。在造模的第24周集中麻醉斷頸處死小鼠，取得肝樣本并拍照，由圖2所示，高濃度DEN組小鼠的肝整體可見大面積壞死，水腫，肉眼可見大量的癌結節。低濃度DEN組與DEN+CCl4組小鼠肝的表面較為光滑，癌結節的數量少于高劑量DEN組。

2.3 各組小鼠的腫瘤數目及腫瘤發生率的比較

取得各組小鼠肝樣本后對肝的腫瘤數目及發生率進行分析，如圖3所示，對照組小鼠肝無腫瘤生長，肝癌發生率為0%，低劑量DEN組小鼠肝肉眼可見9處腫瘤，肝癌發生率為35%，高劑量DEN組小鼠肝肉眼可見9處腫瘤，肝癌發生率為86%，DEN+CCl4組小鼠肝肉眼可見20處腫瘤，肝癌發生率為56%。

2.4 各組小鼠血清ALT、AST、AFP、GP73的表達水平

在造模的第24周處死各組小鼠取得血清標本后分別對小鼠血清ALT、AST、AFP、GP73的表達水平進行檢測。如表1所示，低劑量DEN組、高劑量DEN組、DEN+CCl4組小鼠的血清ALT、AST、AFP、GP73表達水平顯著高于對照組(P<0.001)。ALT與AST可以發映出肝的炎性損傷程度，AFP與GP73是肝癌的腫瘤標記物，其數值明顯高于對照組均可反映出肝癌造模成功。值得注意的是GP73在高劑量DEN組小鼠的血清表達水平升高得更為明顯。

注：箭頭表示腫瘤之所在。

注：與對照組相比，***P<0.001。

Table1Serum expression levels of ALT, AST, AFP, and GP73 in each group of mice

組別GroupsALT(U/L)AST(U/L)AFP(ng/mL)GP73(ng/ml)對照組Control group11.32±1.92 7.15±2.30 0.72±0.20 4.10±1.06 低劑量DEN組Low-dose DEN group43.30±1.61???44.42±2.01???6.04±0.53??137.30±14.64???高劑量DEN組High-dose DEN group60.06±5.25???71.64±6.20???6.61±0.44??205.52±9.71???DEN + CCl4組DEN + CCl4 group39.63±5.94???43.55±1.67???4.52±0.49??103.51±15.07???

注：與對照組相比，**P<0.01，***P<0.001。

Note.Compared with the control group,**P< 0.01,***P< 0.001.

3 討論

肝細胞癌的發生與發展是一個多步驟、多因素的進程[9]。在肝細胞癌中，可以觀察到急、慢性肝損傷，肝的炎性病變，肝細胞的變性、再生、壞死等等與小細胞形態學相關的腫瘤癌前病變[10]。肝細胞癌的發病率往往表現出與區域性和種族相關的差異[11]。一些DNA損傷性化學物質與細胞毒性物質被認為是肝細胞癌發生的根本原因，諸如二乙基亞硝胺(DEN)，四氯化碳(CCl4)，全氟化學品，全氟辛酸，苯并芘，丙烯酰胺，膳食污染物等等[12-14]。進行肝細胞癌的研究，建立穩定有效的動物模型是必不可少的，也是肝癌的發生發展研究的基本必要條件之一。

目前建立小鼠的肝癌模型以化學誘導法多見，其中又以二乙基亞硝胺(DEN)與四氯化碳(CCl4)為主要的誘癌劑。使用化學誘導法造模大多選擇用兩周齡小鼠[15-16]，有研究指出，幼鼠的肝組織極易發生癌變，而且酶的活性會隨著小鼠年齡增長，大概在1～2周時達峰值[17]。由于化學誘導法建立小鼠原發性肝癌模型的時間多為24～48周[18-19]，故選用建模后第24周集中處死各組小鼠。本實驗選用兩種不同濃度的DEN(25 mg/kg，40 mg/kg)以及DEN與CCl4聯合應用進行小鼠原發性肝癌造模。DEN與CCl4聯合應用的方法需每間隔一段時間進行CCl4的注射，這使得造模過程過于繁瑣，每一次對實驗動物的注射無法保證絕對相同的劑量和與上次注射相近的實驗環境。此法最終雖可成功建立小鼠原發性肝癌模型，但是肝細胞癌的形成是一個動態且持續的過程，不斷的施加干擾措施會影響到小鼠肝細胞癌形成過程中的諸多指標，尤其對需要持續的進行稱重、監測生存曲線、檢測血清各項生化指標的動態變化實驗尤為不利，加大了不穩定因素的干擾，往往使實驗結果不夠理想。

單獨使用DEN建模可成功的建立肝癌模型，但是在劑量上始終沒有明確的統一規定[20]，通過本實驗結果可知高劑量DEN組(40 mg/kg)于24周時成瘤率可達86%，而低劑量DEN組與DEN+CCl4組于24周的成瘤率分別為35%與56%，結果表明高劑量的DEN(40 mg/kg)可以更快速穩定的建立小鼠原發性肝癌的模型。前文數據可知本次實驗高劑量DEN組小鼠死亡率達30%，由于DEN本身的急性肝毒性較大，對于幼鼠在造模的早期易使其夭折并可致更高的死亡率，故采取本法需要準備足量的小鼠進行造模，最大限度的減少由于造模初期存在的高死亡率所造成的實驗誤差。單獨使用DEN并在25 mg/kg的基礎上增加劑量到40 mg/kg 建立小鼠肝癌模型，此法雖有不足之處，但是其優勢較低劑量DEN(25 mg/kg)與DEN+CCl4聯合使用更加突出，主要在于更快速的建立小鼠原發性肝癌模型，大幅度的縮短了實驗時間，一次注射之后避免了后續的再次注射染毒操作，使得實驗難度降低的同時也使得模型建立的過程比較平穩，無過多的外界干擾因素，尤其是對于需要進行在造模過程中動態監測小鼠血清生化指標的實驗極具優勢，可以最大限度的避免實驗誤差，使得實驗結果更為理想。有研究認為GP73是肝癌最有價值的標志之一，并通過多種途徑參與肝癌的發展[21]。GP73也在膽囊癌，胰腺癌，肺癌，膀胱癌和其他癌癥中高表達，GP73的高表達和預后不良與種種惡性生物學行為(如腫瘤大小、侵襲、遷移)密切相關[22-24]。由此可知GP73相對于AFP具有更高的敏感性，對于肝癌手術的預后的評估，GP73也表達出更精準的可靠性[25]。因此，本實驗檢測了小鼠血清GP73的表達水平，值得注意的是，高劑量(40 mg/kg)DEN組的小鼠血清GP73的升高水平尤為明顯，這也間接的反映出了高劑量(40 mg/kg)DEN建立的小鼠原發性肝癌模型更具說服力。

綜上，高劑量(40 mg/kg)DEN建立小鼠原發性肝癌模型簡單易行，造模時間短，腫瘤發生率及肝癌的嚴重程度更高，這為進一步研究肝癌的發生與發展提供了更為合理有效的動物模型。