長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00152對(duì)人腦膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及機(jī)制探討

金 亮，金 愛(ài)，趙立智

(1.滄州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 滄州 061000；2.滄州市人民醫(yī)院輸血科，河北 滄州 061000)

腦膠質(zhì)瘤(brain glioma)是常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，當(dāng)前其主要治療手段為手術(shù)切除聯(lián)合化學(xué)治療和放射治療[1]。腦膠質(zhì)瘤惡性程度較高，且常規(guī)化療藥物難以通過(guò)血腦屏障，臨床治療效果往往不佳[2]。因此，如何有效治療腦膠質(zhì)瘤是臨床面臨的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。LINC00152屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)，并異常表達(dá)于肝癌、胃癌及結(jié)腸癌等惡性腫瘤細(xì)胞中[3-5]。文獻(xiàn)報(bào)道，LINC00152參與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[3-5]。最新研究顯示，LINC00152與腦膠質(zhì)瘤臨床不良預(yù)后相關(guān)，下調(diào)LINC00152基因表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)[6]。還有研究顯示，上調(diào)LINC00152可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲[7]。這些提示，LINC00152與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為相關(guān)，能促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)為一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，主要在Hippo通路下游發(fā)揮細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控作用[8]。但YAP是否參與LINC0015對(duì)腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)還未有研究報(bào)道。本研究以慢病毒轉(zhuǎn)染法上調(diào)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞LINC00152表達(dá)水平并建立荷瘤鼠模型，觀察LINC00152對(duì)腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的影響及YAP在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性BALB/c nu/nu裸鼠60只，SPF級(jí)，5～6周齡，體重13～15 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK (京)2016-0006]，質(zhì)量合格證號(hào)：No.11400700329359。動(dòng)物飼養(yǎng)于滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房[SYXK (冀)2019-006]IVC籠中，每籠6只，自由飲水、攝食，12 h光照/12 h黑暗，溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)了滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物管理和倫理委員會(huì)審批，審批號(hào)：CPH1702。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 細(xì)胞株

人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞(目錄號(hào)：TCHu 58)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑與儀器

XMU-MP-1(貨號(hào)HY-100526)購(gòu)自美國(guó)MCE公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、MEM培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Ki67抗體(貨號(hào)sc-23900)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；YAP抗體(貨號(hào)4912)、Phospho-YAP(Ser127)(貨號(hào)D9W2I)抗體(貨號(hào)13008)、Phospho-LATS1(Ser909)抗體(貨號(hào)9157)購(gòu)自美國(guó)CST公司；LATS1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(貨號(hào)ab70561)；GAPDH抗體(貨號(hào)AP0063)、抗兔IgG-HRP二抗(貨號(hào)BS13278)、抗鼠IgG-HRP二抗(貨號(hào)BS12478)購(gòu)自南京巴傲得公司；HS 15(貨號(hào)42966)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；TRIzol和RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海碧云天公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自大連寶生物公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；EnVision法免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自丹麥Dako公司。全波段多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；AI600凝膠成像儀，美國(guó)GE公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；Allegra 64R Centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建LINC00152穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株

慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建LINC00152過(guò)表達(dá)組(LV-LINC00152組)和空載對(duì)照組(LV組)細(xì)胞，同時(shí)以正常U251作為空白對(duì)照組(control組)。將U251細(xì)胞以每孔3×106個(gè)接種于六孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。LV-LINC00152組和LV組細(xì)胞更換為含10 μg/mL Polybrene的MEM全培養(yǎng)基，加入以培養(yǎng)基稀釋好的空載和LINC00152包裝的病毒液，空白組細(xì)胞加入等量培養(yǎng)基，37℃、5% CO2過(guò)夜培養(yǎng)，12 h時(shí)更換為MEM全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期傳代，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LINC00152表達(dá)水平

收集LV-LINC00152組、LV組和對(duì)照組細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，用酶標(biāo)儀對(duì)各組細(xì)胞總RNA濃度進(jìn)行定量，各取1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，稀釋反轉(zhuǎn)錄好的cDNA至500 μL，充分混勻備用。各引物按正向引物與反向引物1∶1稀釋，利用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ在ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃，10 s；95℃，10 s，60℃，60 s，40個(gè)循環(huán)，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔。2-△△Ct法計(jì)算LINC00152的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 蛋白印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

將各組動(dòng)物腫瘤組織剖下，切割0.5 g腫瘤組織并加入500 μL RIPA細(xì)胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)研磨裂解10 min，12 000 r/min離心20 min，吸取上清液至預(yù)冷的EP管中，采用BCA蛋白定量試劑盒定量，制備蛋白樣品。以SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品中的蛋白質(zhì)(上樣量為30 μg)；將分離的蛋白濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；轉(zhuǎn)膜完成后以5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h；然后按要求加入YAP(1∶2000)、p-YAP(1∶1000)、LATS1(1∶1000)、p-LATS1(1∶1000)或GAPDH抗體(1∶5000)4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜3次，再加入相應(yīng)的二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，以ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色，凝膠成像儀進(jìn)行成像，對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 免疫組化及結(jié)果判斷

所有組織標(biāo)本按EnVision法進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋、脫蠟、切片、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶、封閉劑孵育一抗(1∶1000)、孵育EnVisionTM、孵育色源底物溶液和顯色拍照。一抗為小鼠單克隆Ki-67抗體，需4℃過(guò)夜，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

Ki67蛋白定位于細(xì)胞核，出現(xiàn)棕黃色顆粒顯色為陽(yáng)性。隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，采用免疫組織化學(xué)評(píng)分方法半定量分析，分別計(jì)算各視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均百分比和染色強(qiáng)度。計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。評(píng)價(jià)陽(yáng)性染色強(qiáng)度，無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最終評(píng)分為兩項(xiàng)評(píng)分相乘：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.3.5 腫瘤模型的建立及分組給藥

于每只裸鼠右腋下接種U251細(xì)胞2×106個(gè)，總體積0.1 mL(含0.05 mL Matrigel膠)。接種后觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，最終以瘤體積100 mm3左右為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，剔除瘤體積過(guò)大或過(guò)小的動(dòng)物，選取合格動(dòng)物納入實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)一分組：分別以轉(zhuǎn)染空載體的LV組細(xì)胞和過(guò)表達(dá)LINC00152的LV-LINC00152組細(xì)胞荷瘤，篩選合格的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，前者設(shè)為L(zhǎng)V組，后者設(shè)為L(zhǎng)V-LINC00152組；

實(shí)驗(yàn)二分組：以LV-LINC00152組細(xì)胞荷瘤并篩選合格的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為生理鹽水組(normal saline組)、XMU-MP-1(3 mg/kg)組和XMU-MP-1(1 mg/kg)組。

將XMU-MP-1溶解于HS 15中，并以生理鹽水稀釋XMU-MP-1溶液，同時(shí)配制含等量HS 15溶劑的生理鹽水作為對(duì)照。XMU-MP-1給藥劑量為1 mg/kg和3 mg/kg，每周給藥3次，共給藥3周，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄腫瘤長(zhǎng)徑、短徑，按照以下公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積=1/2 ×長(zhǎng)徑×短徑2，瘤徑測(cè)量時(shí)間分別為：分組前測(cè)量瘤徑1次，首次給藥后每周3次，安樂(lè)死前1次。動(dòng)物安樂(lè)死后剖下腫瘤組織并稱重，取適當(dāng)腫瘤組織用于實(shí)驗(yàn)，其余進(jìn)行固定保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染法外源性上調(diào)模型細(xì)胞LINC00152表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組、LV組和LV-LINC00152組細(xì)胞中LINC00152 mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為(0.33±0.02)、(0.32±0.03)和(1.58±0.13)，對(duì)照組和LV組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與LV組相比，LV-LINC00152組LINC00152 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.2 LINC00152促進(jìn)模型細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)

實(shí)驗(yàn)期間，各組動(dòng)物生長(zhǎng)狀態(tài)良好，體重隨時(shí)間逐漸增加，組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。如圖2A所示，分組給藥后，隨時(shí)間的增加，各組荷瘤鼠腫瘤體積逐漸增大。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，與LV組相比，LV-LINC00152組腫瘤體積顯著增大(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，LV組和LV-LINC00152組瘤重分別為(0.86±0.29)g和(1.21±0.40)g，與LV組相比，LV-LINC00152組瘤重增加明顯(P<0.01)，見(jiàn)圖2B。

注：A：LV組和LV-LINC00152組腫瘤體積，與LV組相比，*P<0.05，**P<0.01；B：LV組和LV-LINC00152組腫瘤圖片，1～5為各動(dòng)物組內(nèi)編號(hào)。

2.3 XMU-MP-1處理抑制LINC00152誘導(dǎo)的模型細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)

如圖3A所示，分組給藥后，隨時(shí)間的增加，各組荷瘤鼠腫瘤體積逐漸增大。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，與生理鹽水組相比，XMU-MP-1(3 mg/kg)組和XMU-MP-1(1 mg/kg)組腫瘤體積顯著減小(P<0.01)，并呈劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，生理鹽水組、XMU-MP-1(3 mg/kg)組和XMU-MP-1(1 mg/kg)組瘤重分別為(1.08±0.41)g、(0.35±0.19)g和(0.68±0.28)g，與生理鹽水組相比，XMU-MP-1(3 mg/kg)組和XMU-MP-1(1 mg/kg)組瘤重顯著減小(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見(jiàn)圖3B。

注：A：生理鹽水組、XMU-MP-1(3 mg/kg)組和XMU-MP-1(1 mg/kg)組腫瘤體積，與生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01；B：生理鹽水組、XMU-MP-1(3 mg/kg)組和XMU-MP-1(1 mg/kg)組腫瘤圖片，1～5為各動(dòng)物組內(nèi)編號(hào)。

2.4 各組腫瘤組織Ki67蛋白表達(dá)變化

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，LV組腫瘤組織Ki67呈弱陽(yáng)性表達(dá)，而LV-LINC00152組腫瘤組織Ki67呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。以生理鹽水組作為對(duì)照，XMU-MP-1處理LV-LINC00152細(xì)胞荷瘤鼠后發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組腫瘤組織Ki67呈強(qiáng)陽(yáng)性，XMU-MP-1(1 mg/kg)組呈陽(yáng)性，而XMU-MP-1(3 mg/kg)組呈弱陽(yáng)性。見(jiàn)圖4。

2.5 各組腫瘤組織p-YAP和p-LATS1蛋白表達(dá)變化

圖4 各組腫瘤組織Ki67蛋白表達(dá)變化(免疫組織化學(xué)染色，× 200)

蛋白印記實(shí)驗(yàn)分析各組腫瘤組織p-YAP和p-LATS1蛋白表達(dá)變化，與LV組相比，LV-LINC00152組腫瘤組織p-YAP和p-LATS1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。以不同濃度XMU-MP-1處理LV-LINC00152組裸鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比，XMU-MP-1(3 mg/kg)和XMU-MP-1(1 mg/kg)處理后p-YAP和p-LATS1蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01)，并存在劑量依賴性。見(jiàn)圖5。

3 討論

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)是堿基組成從200 nt到100 000 nt的非編碼RNA，在細(xì)胞周期調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并涉及神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及惡性腫瘤等多種疾病[9-10]。隨著研究的深入，越來(lái)越多的LncRNA被發(fā)現(xiàn)與腦膠質(zhì)瘤、白血病、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[11-12]。LINC00152是LncRNA大家族的一員，異常表達(dá)于肝癌、胃癌及結(jié)腸癌等惡性腫瘤[13-14]。最新研究顯示，LINC00152與腦膠質(zhì)瘤臨床不良預(yù)后相關(guān)，而下調(diào)LINC00152基因表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)[6]。提示，LINC00152膠質(zhì)瘤中可能發(fā)揮促癌效應(yīng)，能促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)。

注：a：LV組；b：LV-LINC00152組；c：LV-LINC0015 +生理鹽水組；d：LV-LINC0015 + 1 mg/kg XMU-MP-1組；e：LV-LINC0015 + 3 mg/kg XMU-MP-1組。與LV組相比，**P<0.01；與LV-LINC0015 +生理鹽水組相比，△△P<0.01。

本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染法外源性上調(diào)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中LINC00152表達(dá)水平，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)LINC00152的細(xì)胞株。以BALB/c裸鼠建立腦膠質(zhì)瘤U251荷瘤鼠模型發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)LINC00152過(guò)表達(dá)U251荷瘤鼠腫瘤體積和瘤重明顯增大。提示，LINC00152能促進(jìn)U251荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)。這與文獻(xiàn)報(bào)道相類似[6]。Ki67定位于細(xì)胞核，是目前臨床常用的惡性腫瘤增殖活性衡量指標(biāo)之一[15]。本研究觀察了Ki67的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)LINC00152過(guò)表達(dá)U251荷瘤鼠腫瘤組織中Ki67表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照。表明LINC00152能增強(qiáng)U251荷瘤鼠腫瘤組織細(xì)胞的增殖活性。重要的是，本研究還發(fā)現(xiàn)U251荷瘤鼠腫瘤組織中p-YAP和p-LATS1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。LATS1是YAP的上游信號(hào)靶點(diǎn)，當(dāng)LATS1磷酸化后可引起下游效應(yīng)物YAP磷酸化。文獻(xiàn)報(bào)道，敲低腦膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞中YAP的蛋白表達(dá)能顯著抑制細(xì)胞增殖和Ki67蛋白表達(dá)[16]。提示，p-YAP參與U251荷瘤鼠腫瘤的增殖生長(zhǎng)。XMU-MP-1是研究已證實(shí)的YAP抑制劑，能夠抑制p-YAP的表達(dá)[17]。本研究進(jìn)一步采用XMU-MP-1處理LINC00152過(guò)表達(dá)的U251荷瘤鼠。結(jié)果顯示，XMU-MP-1能顯著抑制p-YAP和p-LATS1表達(dá)，同時(shí)還可抑制TV和瘤重的增加以及Ki67蛋白表達(dá)。提示，抑制YAP磷酸化能遏制LINC00152介導(dǎo)的U251荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，LINC00152能通過(guò)磷酸化YAP從而介導(dǎo)U251荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)。文獻(xiàn)顯示，在肝癌、腎癌中及膀胱癌等多種腫瘤細(xì)胞中，YAP磷酸化后從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)中，從而失去其直接的轉(zhuǎn)錄活性[18-20]。提示本研究中YAP的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮。但其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。