人參皂苷Rg3通過TGF-β1/ERK信號通路調控原位荷瘤人肺癌裸鼠的淋巴管生成的機制

陶 濤，汪國文，李其才，黎傳奎

(蚌埠醫學院第一附屬醫院，安徽 蚌埠 233004)

人參在我國具有悠久的使用歷史，在抗腫瘤中也具有一定的功效，人參皂苷Rg3(GS-Rg3)是一種從中藥人參中提取的固醇類中藥單體，具有多種生物學活性，包括對于腫瘤，GS-Rg3具有抑制其增殖、促進細胞凋亡的作用，但是關于其具體機制尚不明確[1]。最近有研究顯示GS-Rg3也具有抑制淋巴管生成的作用，腫瘤細胞通過淋巴管進入淋巴結是肺癌淋巴轉移的主要方式之一，有研究發現轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)在腫瘤中過表達，發揮促增殖的作用，TGF-β1/ERK可以促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達從而促進管生成[2-3]。SCH772984是一種新型特異性的ERK抑制劑，廣泛應用于ERK相關信號通路的研究。因此本文主要分析人參皂苷GS-Rg3對荷瘤人肺癌裸鼠淋巴管生成的機制，并研究其對腫瘤組織TGF-β1/ERK通路以及VEGF表達的影響，分析GS-Rg3的作用機制，為GS-Rg3在臨床治療肺癌提供理論依據和新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

4～5周齡(體重14 g～17 g)的SPF級BALB/c無胸腺雄性裸鼠60只，均購自華東師范大學科學實驗動物中心閔行校區[SCXK (滬)2016-0004]，飼養于華東師范大學科學實驗動物中心閔行校區[SYXK (滬)2015-0011]的獨立通風籠盒中。

1.1.2 細胞系

人肺癌A549細胞購自ATCC(美國)。

1.2 主要試劑與儀器

RPM1-1640培養基以及胎牛血清等培養試劑購自Gibco(美國)；戊巴比妥購自Sigma公司(美國)；GS-Rg3購自齊一生物科技公司(中國，上海)；ERK抑制劑SCH772984購自Sellect公司；HE染色試劑盒購自武漢華美公司(中國)；逆轉錄試劑盒和SYBR Prellix Ex TaqTM實時PCR試劑盒購自TaKaRa(日本)；抗體TGF-β1、ERK、p-ERK、podoplanin、VEGF-C、VEGF-3以及相關二抗均來自Abcam公司(美國)；PVDF膜(Bio-Rad，美國)；PCR引物由Genewiz(中國)設計和合成。顯微鏡Nikon(日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 荷瘤裸鼠分組、建模及干預方法

將60只小鼠隨機分為3組，各20只，即模型組、GS-Rg3組和ERK抑制劑SCH772984組(以下簡寫為SCH772984組)。根據文獻[4]建立人肺癌裸鼠原位移植模型，將生長良好的A549細胞分裂并在新鮮培養基中再生長一天，皮下注射全部小鼠，注射細胞數為5×106個，待瘤體生長至10 mm使剝離瘤體移植至模型組、GS-Rg3組和SCH772984組的小鼠肺組織。GS-Rg3組小鼠在移植后第3天使用GS-Rg3灌胃，每只0.8 mg/kg，SCH772984組小鼠移植后第3天腹腔注射SCH772984，每只12.5 mg/kg，每3 d一次，飼養28 d后處死小鼠進行檢驗。實驗過程遵循3R原則，并通過蚌埠醫學院第一附屬醫院實驗動物使用與管理委員會批準(H 2017123546)。

1.3.2 腫瘤生長情況以及病理學檢查

戊巴比妥腹腔注射(60 mg/kg)麻醉后處死大鼠，打開胸腔，觀察肺癌生長和轉移情況，并取出肺組織，測量腫瘤體積，使用HE染色檢測肺組部組織學變化，按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 免疫組化染色

肺癌原位移植瘤組織用甲醛和石蠟固定，將切片(4.0 μm)脫石蠟并再水合，抑制內源性過氧化物酶活性，首先封閉切片并在4℃下用VEGF-C、VEGF-3或podoplanin抗體孵育過夜，然后在室溫下與生物素化的抗小鼠IgG孵育30 min，隨后染色，顯微鏡觀察，根據文獻報道的方法[5]計算淋巴管密度。

1.3.4 qPCR

qPCR用于檢測肺癌原位移植瘤組織中mRNA水平，組織裂解后收集總mRNA，通過95℃激活DNA聚合酶5 min進行PCR，然后進行40個循環的兩步PCR(95℃，10 s和60℃，30 s)，最終75℃延伸10 min，保持在4℃，GAPDH作為內參，使用2-ΔΔCT法分析mRNA水平。

1.3.5 Western blot

使用Western blot檢測肺癌原位移植瘤組織中蛋白水平。在液氮的保護下裂解組織，在12 000 r/min，4℃離心15 min收集上清液，使用BCA方法確定蛋白質濃度。使用10%的SDS-PAGE凝膠用于電泳，電泳后使用PVDF膜轉膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h，后在4℃孵育過夜，加入二抗。使用GAPDH作為內參。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 建模及干預情況

模型組和各干預組小鼠肺癌模型均建立成功，并通過HE染色病理檢查證實肺癌以及肺癌淋巴轉移，見圖1。干預后21 d模型組小鼠死亡1只，其余小鼠無死亡。GS-Rg3組和SCH772984組小鼠出現淋巴轉移的比例、腫瘤體積和腫瘤質量均顯著低于模型組，GS-Rg3組和SCH772984組無顯著差異，見表1。

2.2 各組淋巴微管著色情況比較

本次研究使用podoplanin蛋白標記淋巴管，圖2中褐色為podoplanin染色，可用于反映淋巴管生長情況。結果顯示GS-Rg3組和SCH772984組podoplanin蛋白表達水平和淋巴管相對密度顯著低于模型組，而GS-Rg3組和SCH772984組無顯著差異，其免疫組化染色結果見圖2、表2。

注：箭頭指示淋巴轉移。標尺=100 μm。

Table1Comparison of lymphatic metastases and lung tumor volumes of the mice in each group

組別Groupsn淋巴轉移個數及百分比Number and percentage of lymphatic metastases腫瘤體積(mm3)Tumor volume腫瘤質量(g)Tumor mass模型組Model group1915(78.95%)583.43±18.540.72±0.21GS-Rg3組GS-Rg3 group207(35.00%)??302.93±17.51??0.29±0.17??SCH772984組SCH772984 group205(25.00%)??231.45±14.25??0.21±0.14??

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note.Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

表2 各組小鼠podoplanin蛋白表達水平

注：與模型組比較，*P<0.05。

Note.Compared with the model group,*P<0.05.

2.3 各組TGF-β1/ERK通路表達水平比較

GS-Rg3組和SCH772984組可以顯著抑制TGF-β1和ERK mRNA的表達，并且GS-Rg3組和SCH772984組的p-ERK/ERK水平顯著低于模型組，而GS-Rg3組和SCH772984組無顯著差異，說明GS-Rg3可抑制TGF-β1/ERK通路的激活，見表3和圖3。

2.4 各組腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-3表達水平比較

免疫組化檢測結果顯示GS-Rg3和SCH772984的VEGF-C、VEGF-3表達水平較模型組低，而GS-Rg3組和SCH772984組無顯著差異，見圖4、圖5和表4。

表3 各組小鼠TGF-β1、ERK mRNA和蛋白表達水平比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note.Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

圖3 Western blot檢測各組小鼠中TGF-β1、p-ERK和ERK蛋白水平

3 討論

肺癌的發病率及病死率均高居首位，調查顯示2015年我國肺癌新發病例數達到73.3萬，死亡病例高達61萬，并且其發病率和死亡率仍呈現上升趨勢[6]。雖然隨著新的激酶抑制劑藥物、放療新方法被不斷應用于臨床，肺癌患者的短期療效有了顯著的提升，但是肺癌的復發率和轉移情況仍未得到顯著的改善，并且對于化療藥物的耐藥問題仍未得到有效的解決[6]。

中藥在治療腫瘤中取得了一定的進展，可能成為治療肺癌的新方法。人參在中國具有悠久的使用歷史，已經有研究發現人參也具有較好的抗腫瘤作用，人參可以抑制胃癌細胞的生長并促進其凋亡[7]。分析人參中的抗腫瘤活性成分并探究其抗腫瘤機制是研究的熱點，也是將中藥在臨床上大范圍推廣的重要手段，GS-Rg3是人參的主要活性成分之一，可以抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，從而抑制腫瘤生長和轉移，但是關于其對肺癌作用的相關機制的研究還不足[8-9]。血管以及淋巴管的形成是腫瘤向遠端轉移的主要途徑，目前關于GS-Rg3在腫瘤管生成中的研究不多，最近的也有研究顯示GS-Rg3也具有抑制血管生成的作用[10]，關于GS-Rg3對腫瘤淋巴管形成的影響研究極少。肺癌細胞進入淋巴管是肺癌淋巴轉移的主要途徑，淋巴轉移患者的預后較差，為研究GS-Rg3對淋巴管生成的影響，我們建立了人肺癌裸鼠原位移植模型，并分別使用GS-Rg3干預，通過HE染色監測腫瘤建模情況和淋巴轉移情況。結果顯示模型組淋巴轉移率為78.95%，而GS-Rg3可顯著抑制淋巴轉移情況，并且GS-Rg3也顯著抑制腫瘤的質量和體積。為進一步分析GS-Rg3對淋巴管生成的影響，我們使用podoplanin蛋白標記淋巴管，結果顯示模型組淋巴管較為豐富，而GS-Rg3可抑制podoplanin蛋白表達水平，減少淋巴管生成。國內已有臨床研究顯示GS-Rg3在治療中晚期肺癌中的作用[11]，并且也有動物體內實驗證實通過納米材料遞送GS-Rg3可以抑制小鼠肺癌模型的生長[12]。國外也有研究顯示，GS-Rg3在異種移植小鼠模型中可以降低腫瘤體積和重量，并通過尾靜脈注射顯著降低肺組織中的腫瘤轉移結節，GS-Rg3可通過下調FUT4介導的EGFR失活和阻斷MAPK和NF-κB信號通路來抑制上皮間充質轉化過程和肺癌的侵襲，研究還認為GS-Rg3可能是治療肺癌的潛在有效藥物[13]。此外，Rg3在異種移植小鼠模型中降低腫瘤體積和重量，并通過尾靜脈注射顯著降低肺組織中的腫瘤轉移結節。戴曉軍等[14]研究也發現了GS-Rg3對淋巴管生成中的抑制作用。這說明GS-Rg3可以通過抑制肺癌組織中淋巴管的生成抑制淋巴轉移。這說明了GS-Rg3可以抑制肺癌的生長以及荷瘤裸鼠腫瘤組織中的淋巴管的生成，從而減少了肺癌的淋巴轉移。為進一步分析GS-Rg3抑制淋巴管生成的機制，使用ERK抑制劑SCH772984作為陽性對照，分析其對TGF-β1/ERK信號通路和VEGF的表達水平的影響。TGF-β1/ERK信號通路在肺癌組織中過表達，并可通過調節細胞周期、凋亡以及上皮間充質轉化等相關蛋白促進肺癌的增殖、轉移并抑制其凋亡，而抑制TGF-β1/ERK信號通路可有效的抑制腫瘤細胞的增殖并促進其凋亡，并且具有抑制腫瘤組織血管生成、淋巴管生成的作用[15]。VEGF可以高度特異性的促血管內皮細胞生長，不但可以促進腫瘤組織血管生長，還具有促進遷移侵襲的作用，此外，VEGF也具有促進淋巴管內皮細胞生長的作用，幾乎在所有的腫瘤組織中VEGF的表達水平均上調。上調VEGF的表達可促進血管和淋巴管的生長從而為腫瘤生長提供養分養料以及促進腫瘤的轉移，并且抑制VEGF的表達也是有效減少腫瘤生長和抑制腫瘤轉移的方法[16]。本次研究結果顯示SCH772984可以抑制肺癌原位移植瘤組織中的淋巴管生成，并且GS-Rg3和SCH772984可以顯著抑制TGF-β1和ERK mRNA的表達，并且GS-Rg3和SCH772984可以顯著抑制ERK磷酸化，抑制TGF-β1/ERK信號通路轉導，并抑制VEGF-C、VEGF-3蛋白的表達。TGF-β1/ERK信號通路被激活后會促進多種腫瘤相關蛋白的表達，抑制TGFβ信號通路抑制VEGF的表達，從而減少腫瘤細胞浸潤[17]。Liu等[18]的研究也發現抑制ERK通路也具有抑制VEGF表達的作用，從而抑制胰腺癌的血管生成。也有研究顯示VEGF等蛋白的過表達也可以激活ERK等相關通路促進腫瘤細胞的遷移和侵襲引起腫瘤的轉移和淋巴轉移[19]。Tang等[20]的研究顯示GS-Rg3可通過抑制TGF-β/Smad和ERK信號通路在體外抑制瘢痕成纖維細胞增殖以及血管生成，說明GS-Rg3具有抑制制TGF-β以及ERK信號通路的作用。Cao等[21]的研究發現GS-Rg3可以抑制子宮內膜異位癥大鼠VEGF的表達。國內也有研究顯示在原代喉鱗癌細胞以及人喉鱗癌裸鼠移植瘤中，GS-Rg3可以抑制TGF-β、VEGF-C蛋白的表達[22-23]。這提示在人肺癌裸鼠原位移植中，GS-Rg3可能通過抑制TGF-β1/ERK信號通路調節VEGF的水平，從而抑制腫瘤組織中淋巴管的生成，從而減少腫瘤的淋巴轉移。

注：箭頭所示褐色為VEGF-C陽性染色。標尺=20 μm。

注：箭頭所示褐色為VEGF-3陽性染色。標尺=20 μm。

表4 各組小鼠腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-3表達水平

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note.Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

綜上所述，GS-Rg3可以通過下調TGF-β1/ERK信號通路的轉導水平抑制VEGF-C、VEGF-3蛋白的表達，從而抑制淋巴管的生成降低肺癌的淋巴轉移率，這提示GS-Rg3對于晚期或淋巴轉移肺癌的治療作用。但是關于GS-Rg3抑制淋巴管生成的機制和臨床效果還需要進一步研究。