毛蕊異黃酮減輕缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞損傷

張彐寧，靳曉飛，唐敬龍，趙艷萌，周曉紅，高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050091)

腦卒中(stroke)發(fā)病率逐年攀升，發(fā)病人群已經(jīng)出現(xiàn)年輕化趨勢，嚴(yán)重影響著居民身體健康和生活質(zhì)量，給患者家庭和社會造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腦卒中可分缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類，其中缺血性腦卒中更為多見。溶栓治療是缺血性腦卒中的首選治療方法，由于溶栓后缺血血管的再灌注，會給患者帶來再次損傷，故療效不佳。因此，尋求特效藥物已成為防治缺血性腦卒中的研究重點(diǎn)。目前，臨床上應(yīng)用中藥黃芪治療缺血性腦卒中已取得良好效果，但其具體藥效成分尚未完全證實(shí)，亟待探究。毛蕊異黃酮(calycosin)是黃芪黃酮類的有效單體成分，研究發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮具有抗氧化、抗炎、抗病毒、保肝、延緩衰老等生物作用[1]，但其在缺血性腦卒中方面尚缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)采用缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞模型，模擬神經(jīng)元體外缺血再灌注的環(huán)境，在細(xì)胞水平，探討毛蕊異黃酮對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞損傷的影響，為篩選黃芪治療缺血性腦卒中的藥效成分提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系，經(jīng)過神經(jīng)生長因子NGF處理后具有神經(jīng)元的相關(guān)特性)購自Boster公司。

1.2 主要試劑與儀器

毛蕊異黃酮購自上海士峰生物制品有限公司，20 mg/瓶，純度≥ 98%；CCK-8試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Bcl-2抗體、Bax抗體、DAPI染色劑、Cy3和Alexa Fluor488熒光二抗均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；PI染色劑購自美國Sigma公司；caspase-3抗體購自Gene Tex公司；LDH試劑盒購自南京建成生物工程研究所；青鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；Earle’s平衡鹽溶液購自安徽雷根生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司。

SW-CJ-ID型超凈工作臺購自蘇州凈化公司；Axio Observer 7型倒置熒光顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司；DPX-9052B-1型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；3111型二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱、Multiskan FC型酶標(biāo)儀、3131型三氣培養(yǎng)箱均購自美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及PC12細(xì)胞模型的建立

將PC12細(xì)胞隨機(jī)分為5 組：正常對照組(control組)、缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)組(model組)、毛蕊異黃酮高劑量(0.140 μmol/L)組、毛蕊異黃酮中劑量(0.070 μmol/L)組、毛蕊異黃酮低劑量(0.035 μmol/L)組。正常對照組采用DMEM培養(yǎng)液(10%胎牛血清)于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng)，其余各組細(xì)胞均建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型：用無糖Earle’s平衡鹽溶液替代DMEM培養(yǎng)液，置于三氣培養(yǎng)箱(94% N2、5% CO2、1% O2)內(nèi)培養(yǎng)2 h，即氧、糖剝奪2 h，之后模型組更換為DMEM培養(yǎng)液，給藥組則更換為含有不同濃度毛蕊異黃酮(0.140 μmol/L、0.070 μmol/L、0.035 μmol/L)的培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，即復(fù)氧復(fù)糖24 h。

1.3.2 CCK-8法檢測各組細(xì)胞活性

各組細(xì)胞以1×106/L的密度接種于96孔板，OGD/R造模和給藥處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于CO2培養(yǎng)箱中孵育50 min，酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長下的吸光(OD)值。OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.3 LDH法檢測各組細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率

造模和給藥處理后，取出各組細(xì)胞，按照LDH試劑盒操作步驟，在96孔板中分別加入各組細(xì)胞上清液和LDH試劑，充分混勻，室溫靜置5 min，酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長下的吸光(OD)值，此為細(xì)胞上清液中的LDH含量。之后向原含有細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)加入1% Tritonx-100，室溫破膜20 min后，取細(xì)胞培養(yǎng)液和LDH試劑混勻，室溫靜置5 min，酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長下的吸光(OD)值，此為細(xì)胞破膜液 LDH釋放量。LDH漏出率(%)=上清LDH/(上清LDH+細(xì)胞破膜液LDH)×100%。

1.3.4 PI熒光染色觀察各組細(xì)胞膜完整性

配制PI工作液20 μg/mL于PBS中，避光配置，現(xiàn)配現(xiàn)用，取出各組細(xì)胞爬片，PBS清洗1 min×3次，加入PI工作液，37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，PBS清洗5 min×3次，待細(xì)胞爬片稍干后，封片，紅染的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，觀察各組細(xì)胞的熒光表達(dá)。PI陽性細(xì)胞發(fā)生率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.5 免疫組化法檢測各組細(xì)胞caspase-3表達(dá)

細(xì)胞傳代時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞爬片預(yù)培養(yǎng)，之后給予造模給藥處理，取出各組細(xì)胞爬片，用含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液固定25 min，室溫干燥5 min，PBS清洗2 min×3次，待爬片甩干后，每個(gè)爬片滴加50～100 μL 0.2% Triton X-100細(xì)胞破膜液，室溫破膜20 min，5%山羊血清封閉20 min，甩掉封閉液后，滴加caspase-3單克隆抗體(1∶600)，4℃過夜，洗去一抗，滴加山羊抗兔IgG(1∶200)二抗，37℃孵育60 min，洗去二抗，DAB顯色15 min，蘇木素復(fù)染10 min，脫水，透明，封片。顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，采用Image J軟件分析caspase-3平均光密度值，用積分光密度IOD/Area表示。

低噪聲放大器選用飛利浦的BGA2001，它是一款可應(yīng)用于低電壓情況的單片微波集成放大器，最大電源電壓為4.5 V；在1～1.6 GHz頻段內(nèi)，即包含衛(wèi)星導(dǎo)航信號的工作頻段內(nèi)，增益高達(dá)20 dB，噪聲系數(shù)低至1.3 dB。圖2是設(shè)計(jì)的低噪放電路。

1.3.6 免疫熒光法檢測各組細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)

各組細(xì)胞爬片、固定、破膜同上述免疫組化步驟，各組細(xì)胞破膜后，加4% BSA室溫封閉30 min，甩掉封閉液后，滴加Bax抗體(1∶100)和Bcl-2抗體(1∶100)50～100 μL于爬片上，4℃過夜，洗去一抗，滴加山羊抗小鼠IgG(1∶300)和驢抗兔IgG(1∶200)二抗，室溫避光孵育60 min，洗去二抗，滴加DAPI染液室溫避光10 min，封片，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，觀察各組細(xì)胞的熒光表達(dá)。Bax為紅色熒光，Bcl-2為綠色熒光，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析Bax與Bcl-2的熒光強(qiáng)度值，并計(jì)算Bax/Bcl-2比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)

Control組細(xì)胞形態(tài)飽滿，折光性較好；與control組相比，OGD/R處理后，PC12細(xì)胞的折光性降低，突觸減少，細(xì)胞干癟，細(xì)胞數(shù)量減少；與model組相比，calycosin中劑量組和calycosin低劑量組顯著改善OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，PC12細(xì)胞突觸增多，胞體變圓，且與calycosin低劑量組相比，calycosin中劑量組細(xì)胞恢復(fù)較好；calycosin高劑量組與model組相比無明顯差異。見圖1。

注：A：正常對照組；B：模型組；C：毛蕊異黃酮高劑量組；D：毛蕊異黃酮中劑量組；E：毛蕊異黃酮低劑量組。

2.2 CCK-8法檢測各組細(xì)胞活性

與control組相比，OGD/R處理后PC12細(xì)胞的活性明顯降低(P<0.05)；與model組對比，calycosin中劑量組和calycosin低劑量組可顯著提高OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活性(P<0.05)，且與calycosin低劑量組相比，calycosin中劑量組細(xì)胞活性較高(P<0.05)；calycosin高劑量組與model組對比無顯著性差異(P>0.05)。見圖2。

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與毛蕊異黃酮低劑量組相比，ΔP<0.05。

2.3 LDH法檢測各組細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率

與control組相比，OGD/R處理后PC12細(xì)胞的乳酸脫氫酶漏出率明顯提高(P<0.05)；與model組對比，calycosin中劑量組和calycosin低劑量組可顯著降低OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率(P<0.05)，且與calycosin低劑量組相比，calycosin中劑量組乳酸脫氫酶漏出率較低(P<0.05)；calycosin高劑量組與model組對比無顯著性差異(P>0.05)。見圖3。

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與毛蕊異黃酮低劑量組相比，ΔP<0.05。

2.4 PI熒光染色觀察各組細(xì)胞胞膜完整性

PI是一種不透膜的紅色熒光染料，不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色。與control組相比，OGD/R處理后，PC12細(xì)胞紅染數(shù)明顯增多(P<0.05)；與model組相比，calycosin中劑量組和calycosin低劑量組紅染細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，且與calycosin低劑量組相比，calycosin中劑量組細(xì)胞紅染數(shù)較少(P<0.05)；calycosin高劑量組與model組相比無明顯差異(P>0.05)。見圖4。

注：A、a：正常對照組；B、b：模型組；C、c：毛蕊異黃酮高劑量組；D、d：毛蕊異黃酮中劑量組；E、e：毛蕊異黃酮低劑量組。A～E：倒置熒光顯微鏡相差下拍攝圖片(× 400)；a～e：倒置熒光顯微鏡下拍攝的熒光圖片(× 400)。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與毛蕊異黃酮低劑量組相比，ΔP<0.05。

2.5 免疫組化法檢測各組細(xì)胞caspase-3表達(dá)

與control組相比，OGD/R處理后PC12細(xì)胞caspase-3表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與model組相比，calycosin中劑量組和calycosin低劑量組可明顯減少caspase-3表達(dá)(P<0.05)，且與calycosin低劑量組相比，calycosin中劑量組caspase-3表達(dá)較低(P<0.05)；calycosin高劑量組與model組對比差異不明顯(P>0.05)。見圖5。

注：A：正常對照組；B：模型組；C：毛蕊異黃酮高劑量組；D：毛蕊異黃酮中劑量組；E：毛蕊異黃酮低劑量組。與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與毛蕊異黃酮低劑量組相比，ΔP<0.05。

2.6 免疫熒光法檢測各組細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)

與control組相比，OGD/R處理后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.05)；與model組相比，calycosin中劑量組和calycosin低劑量組Bax/Bcl-2比值明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡程度減輕，且與calycosin低劑量組相比，calycosin中劑量組降低更明顯(P<0.05)；calycosin高劑量組與model組對比無顯著差異(P>0.05)。見圖6。

3 討論

目前，早期恢復(fù)血流是治療缺血性腦卒中的最好方法，但恢復(fù)血液供應(yīng)也可能加劇缺血組織損傷，產(chǎn)生較為嚴(yán)重的病理反應(yīng)——腦缺血再灌注損傷，其發(fā)生機(jī)制主要涉及細(xì)胞凋亡、鈣超載、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等因素[2]，各因素之間相互作用，致使腦組織產(chǎn)生不可逆性損傷。腦缺血后再灌注引起的遲發(fā)型神經(jīng)細(xì)胞死亡多以細(xì)胞凋亡為主，在線粒體調(diào)控的細(xì)胞凋亡途徑中，Bcl-2蛋白家族發(fā)揮著關(guān)鍵作用，caspase-3在啟動線粒體途徑細(xì)胞凋亡過程中扮演著重要角色。Bcl-2家族蛋白可以與孔蛋白相互作用，使位于線粒體內(nèi)、外膜的通透轉(zhuǎn)換孔PTP開放，大量的有機(jī)溶質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜膨脹破裂，CytC、AIF等釋放入胞質(zhì)，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]。Bax、Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的重要成員，當(dāng)細(xì)胞受到缺血等刺激時(shí)，位于胞質(zhì)中的Bax向線粒體膜聚集，促使線粒體膜通透性改變，進(jìn)而釋放CytC，誘導(dǎo)caspase-3活化，引起細(xì)胞凋亡；而Bcl-2作為一種與線粒體相關(guān)的膜穩(wěn)定蛋白，能夠維持和保護(hù)膜的穩(wěn)定性，與Bax形成異源二聚體，抑制caspase-3活化，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生[4,5]。

中藥黃芪是臨床常用補(bǔ)氣要藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有保元補(bǔ)虛、益衛(wèi)固表、利尿消腫的功效。大量醫(yī)籍記載和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪不僅具有補(bǔ)氣保元的作用，還具有良好的活血化瘀之功。古代醫(yī)家根據(jù)中醫(yī)“氣為血之帥”、“血為氣之母”、“氣能生血”、“氣行則血行”等理論，常以黃芪配伍成方，治療中風(fēng)之半身不遂后遺癥。補(bǔ)陽還五湯即為治療中風(fēng)的代表方劑，重用君藥黃芪，意在氣旺則血行，瘀去則絡(luò)脈通暢，在臨床上應(yīng)用至今，尤其在治療缺血性中風(fēng)方面療效顯著[6-10]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪的主要活性成分包括黃酮、皂苷、多糖三大類成分[11]。研究者通過大量離體或在體實(shí)驗(yàn)，對黃芪主要活性成分進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)黃芪三大主要成分在抗炎、抗氧化、調(diào)控自噬、調(diào)節(jié)血壓、促進(jìn)干細(xì)胞增值、改善認(rèn)知功能障礙等方面均發(fā)揮著重要作用，其中黃芪黃酮類成分更是受到越來越多的關(guān)注[12-15]。

黃芪黃酮類化合物主要包括異黃酮、黃酮、異黃烷和紫檀烷四大類，毛蕊異黃酮(calycosin)是異黃酮類代表性有效單體成分，是檢測黃芪質(zhì)量的重要參考指標(biāo)，具有抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞增殖、延緩衰老、抗炎、抗心肌肥厚等生物作用。LIU等[16]采用B3LYP方法對黃芪中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、芒柄花苷4種成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮的抗氧化活性最為顯著，其抗氧化性明顯高于其它3種成分。朱嘉歡等[17,18]研究表明毛蕊異黃酮與阿魏酸、黃芪甲苷、芒柄花素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可以明顯降低衰老造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)衰老時(shí)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4 蛋白表達(dá)水平，能夠抑制HSCs衰老和促進(jìn)其增殖。趙海鵬等[19]研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮可通過激活A(yù)MPK通路，抑制炎癥因子IL-6和IL-8活性和NF-κB的過度激活，從而減輕PM2.5誘導(dǎo)的小鼠肺泡上皮細(xì)胞系 MLE12細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。

毛蕊異黃酮作為黃芪黃酮類的重要有效單體成分，在抗氧化、抗炎、促進(jìn)細(xì)胞增殖、延緩衰老等方面均有應(yīng)用，但是目前尚缺乏毛蕊異黃酮防治缺血性腦卒中方面的研究，亟需探索。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，建立PC12細(xì)胞的缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(OGD/R)模型模擬神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注環(huán)境，在細(xì)胞水平，探討了不同劑量(高劑量0.140 μmol/L、中劑量0.070 μmol/L、低劑量0.035 μmol/L)毛蕊異黃酮對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮中、低劑量組可明顯提高OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力，降低乳酸脫氫酶漏出率，有效改善OGD/R引起的PC12細(xì)胞皺縮、膜破壞等現(xiàn)象，降低促凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax表達(dá)，提高抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，從而顯著減輕OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，其中毛蕊異黃酮中劑量組效果更為顯著，而高劑量組與模型組比較無明顯差異。表明毛蕊異黃酮可優(yōu)化缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞生長狀態(tài)，提高細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)作用，且其藥物作用無劑量依賴性。目前，毛蕊異黃酮減輕OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷是本課題組針對毛蕊異黃酮在防治缺血性腦卒中方面的一個(gè)初步探討，其具體作用機(jī)制尚不明朗，本課題組將繼續(xù)深入探討毛蕊異黃酮拮抗腦缺血再灌注損傷、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制，為黃芪治療缺血性腦卒中藥效成分的篩選提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。